新しいC8

Scientific Reports volume 13、記事番号: 1785 (2023) この記事を引用

1378 アクセス

6 オルトメトリック

メトリクスの詳細

構造的に多様な新しいグループの C8 置換カフェイン誘導体が合成され、それらの化学的および生物学的特性が評価されました。 これらの誘導体の質量分析、FT-IR、および NMR による特性評価が行われました。 誘導体の細胞傷害活性は、ヒト赤血球 (RBC) を使用して in vitro および in silico 薬物動態研究を使用して推定されました。 化合物の抗酸化能力は、第一鉄イオンキレート活性アッセイを使用して分析されました。 ヘモグロビンからメトヘモグロビンへの酸化を含む酸化損傷から赤血球を保護する誘導体の能力は、ペルオキシルの標準誘導剤として水溶性 2,2'-アゾビス(2-メチル-プロピオンアミジン) 二塩酸塩 (AAPH) を使用して評価されました。ラジカル。 細胞内酸化ストレスのレベルは、蛍光酸化還元プローブ 2',7'-ジクロロジヒドロフルオレセイン ジアセテート (DCF-DA) を使用して評価されました。 結果は、すべての誘導体が、その化学構造に応じて顕著な抗酸化作用および細胞保護作用を有する生体適合性化合物であることを示しています。 誘導体の抗酸化作用および細胞保護活性を説明するために、水素原子移動 (HAT)、ラジカル付加体形成 (RAF)、または一電子移動 (SET) のメカニズム、および誘導体と脂質の特異的な相互作用を説明します。赤血球膜の二重層が提案されています。 この結果は、カフェイン分子の選択された修飾がその抗酸化特性を強化することを示しており、これによりカフェインベースの細胞保護化合物の構造と活性の関係についての知識が広がりました。

活性酸素種 (ROS) は、あらゆる細胞の代謝プロセス中に構成的に生成され、シグナル伝達において重要な役割を果たします。 ROS 生成と細胞の抗酸化防御の間の不均衡は酸化ストレスにつながり、がんや心血管疾患などの文明病の発症につながります1。 したがって、ROS の形成と除去システムによる ROS の除去の間のバランスが細胞生理学において重要な役割を果たします。 このアプローチでは、天然および合成の抗酸化物質の両方が、健康増進効果が証明されているため、製薬および食品化学の観点から多くの注目を集めています2、3、4、5。

カフェイン (1,3,7-トリメチルキサンチン) は、抗酸化能力などの興味深い薬理学的特性を持つ最も重要なプリン アルカロイドの 1 つです6、7、8。 León-Carmona と Galano は、カフェインと ROS の 5 つの反応機構、すなわちラジカル付加物形成 (RAF)、水素原子移動 (HAT)、単一電子移動 (SET)、逐次電子陽子移動 (SEPT)、およびプロトン結合電子移動を提案しました。 (PCET)9. 最後に、RAF はカフェインの直接的な除去効果に関与する主なメカニズムとして特定されました。 ただし、ROS の種類や環境の極性によってメカニズムが変更される場合があります。 カフェインは、反応性の高いヒドロキシルラジカル (・OH)10 の優れたスカベンジャーであることに注意してください。

ヒドロキシルラジカルは、ほとんどの有機分子を攻撃する最も酸化性の高い物質であり、生物学的および環境プロセスにおける重要性のため、集中的に研究されています11。 ・OHラジカルは第一鉄イオンと過酸化水素のフェントン反応（Fe2+ + H2O2 → Fe3+ + ・OH + OH−）により生成されるため、過酸化水素とFe2+の比率が・OHの生成に影響します。 一方、鉄は多くの代謝プロセスにおいて非常に重要であり、赤血球生成中のヘモグロビン (Hb) の合成に不可欠です。 Hb は赤血球 (RBC) の主要なタンパク質成分であり、酸素の結合と酸素の伝達に不可欠ですが、鉄代謝の障害はがんを含むさまざまな病気を引き起こします 12,13。 したがって、鉄キレート化は癌治療の新しい戦略としてすでに提案されており、いくつかの鉄キレート剤がこの目的のために開発されています14、15、16、17。 カフェインは弱い鉄キレート剤 18 ですが、我々は以前、カフェインよりも著しく高い第一鉄イオンキレート活性を持つ新規なジアミンおよびポリアミン カフェイン類似体を報告しました 19。

赤血球は人間の血液の主な細胞成分であり、循環系での寿命 (約 120 日) の間、特に ROS20 を含む内因性化合物と外因性化合物の両方にさらされます。 細胞膜には Hb と高レベルの多価不飽和脂質が存在するため、ROS の有害な影響は他の細胞型と比較して RBC で最も顕著です。 したがって、ROS 依存性赤血球症による赤血球寿命の短縮に対する酸化ストレスの影響が記載されており、抗酸化物質は多くの全身性疾患に対する抗赤血球症および抗貧血薬として同定されています 21。 カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、グルタチオンペルオキシダーゼなどの酵素的抗酸化物質は、ROS の有害な影響を最小限に抑えますが、ROS を中和する RBC の能力には限界があります。 したがって、抗酸化特性を持つ分子は、酸化ストレス下での生存率を向上させるために赤血球によって使用されます 22,23。 細胞膜に取り込まれる能力を持つ食事性抗酸化物質は、メトヘモグロビン（MetHb）への酸化から Hb を保護できることが確認されています 24。 これは生理学的観点から非常に重要です。なぜなら、酸化第二鉄 (Fe2+) から第二鉄 (Fe3+) を含む MetHb は、酸素 (O2) を結合して組織に輸送することができず、その結果、急性または慢性の低酸素症が発生する可能性があるからです。 低酸素症は、がん、代謝性疾患、慢性心臓病、腎臓病、心筋虚血などの主要な死亡原因の発症に関与しています25。 赤血球膜の特性と血液の粘度に対する長期の低酸素状態の影響も記載されています26。 さらに、重症の新型コロナウイルス感染症患者の血液中の MetHb レベルが著しく上昇していることが最近報告されています 27。 カフェインは、免疫調節、気管支拡張、細胞内ウイルス転写の阻害を促進することにより、直接的および間接的に、SARS-CoV-2 感染に関連して健康上の利点があることも示唆されています28。 さらに、カフェインは赤血球細胞膜を通過し、最も有害なヒドロキシルラジカルを除去し、カスパーゼ-3の活性化とMetHbの形成を防ぎます29。 疎水性相互作用と水素結合相互作用によって安定化されたカフェイン-Hb 複合体の形成は、in vitro 30 および in silico 研究 29 で確認されています。 興味深いことに、カフェインの代謝物である 1-メチル尿酸は、亜硝酸塩による Hb 酸化をカフェインよりもよく阻害します 31。 結論として、カフェイン、その代謝産物および誘導体は、Hb の酸化に対する保護効果を持つ興味深い抗酸化物質であり、さまざまな生物医学への応用が見込まれる可能性があります。 さらに、核および他の細胞小器官を欠く赤血球は、天然および合成化合物と細胞膜および Hb との相互作用を in vitro で評価するための便利なモデルを提供します 32,33,34。

この研究の目的は、新しい C8 置換カフェイン誘導体を合成し、2,2'-アゾビス (2-メチル-プロピオンアミジン) 二塩酸塩 (AAPH) から生成されるペルオキシル ラジカルによって誘発される酸化ストレス下での鉄キレート剤および細胞保護剤としてのその効率を評価することでした。ヒトの赤血球では。 酸化ストレス下での赤血球における新しい誘導体の細胞保護効果のメカニズムが提案されています。

我々の以前の研究19では、選択されたジアミンおよびポリアミンカフェイン誘導体が、AAPH由来のフリーラジカルによって誘発されるヒト赤血球の溶血に対して優れたキレート活性および阻害効果を示すことを報告しました。 本研究では、(i) アミド基またはイミド基、(ii) チアゾリジノンまたはピロリジンジチオカルバメート部分、または (iii) アルカジエン置換基 (図 1)。 最初のグループの化合物は、カフェイン誘導体 1 ～ 3 を無水物部分 (マレイン酸、コハク酸、フタル酸、酢酸) で求核的に N 置換することによって得られました (図 1A)。 無水酢酸は第一級アミン基と反応して、イミドおよびアミドカフェイン誘導体（それぞれ化合物 8 ～ 16 および 17 ～ 19）を生成します。 反応は酢酸溶液中で実施した。 あるいは、化合物 1 ～ 3 を塩化クロロアセチルと反応させて、N-置換アセトアミド 1a ～ 3a を生成しました (図 1A)。 このアシル化反応は、酢酸水溶液中、酢酸ナトリウムを触媒として行った。 化合物 1a ～ 3a は、カフェイン誘導体の 2 番目のグループを合成する際の中間生成物でした。 還流エタノール中でチオシアン酸アンモニウムの存在下で化合物 1a ～ 3a を複素環化すると、4-チアゾリジノン 20 ～ 22 が生成しました。 化合物 20 ～ 22 は、分子内環化とジムロート様転位によって形成されました 35。 還流エタノール中でのピロリジンジチオカルバミン酸ナトリウムによる化合物 1a ～ 3a の N-置換反応により、化合物 23 ～ 25 が得られました (図 1A)。 3 番目の化合物グループは、チオフェン誘導体の開環反応によって得られました (図 1B)。

カフェイン誘導体 2 ～ 25 (A) および 26 ～ 30 (B) の合成。

ニトロチオフェンが第二級アミンとの開環反応を起こし、潜在的な薬理学的に活性な化合物をもたらすことが知られています 36,37。 末端第二級アミン基を持つカフェイン類似体 4 ～ 7 は、非対称メチル 4-ニトロチオフェン-2-カルボキシラートと反応してメルカプタン 26 ～ 29 を生成します。 反応は、無水エタノール中のAgNO3の存在下で実施した。 次に、化合物 4 と対称 3,4-ジニトロチオフェン (3,4-DNT) を無水エタノール中で室温で反応させると、1,4-二置換 2,3-ジニトロ-1,3-ブタジエン類似体 30 が生成されました。 -ニトロチオフェン-2-カルボキシレートは市販されており、3,4-ジニトロチオフェンは38に従って3段階の反応によって得られました。 まず、2,5-ジブロモチオフェンをニトロ化して2,5-ジブロモ-3,4-ジニトロチオフェンにした。 次に、置換チオフェンとヨウ化水素酸を室温でアセトン中で混合して２－ブロモ－３，４－ジニトロチオフェンを得、還流酢酸中で銅と反応させて３，４－ジニトロチオフェンを得た。

最終生成物 8 ～ 30 の化学構造は、スペクトル データ分析 (補足から入手可能なデータ) に基づいて割り当てられました。

抗酸化物質の金属キレート活性は、細胞成分の過酸化に関与する鉄濃度の上昇を低下させることができるため、重要です。 さらに、金属キレート化は、金属を効果的なキレート剤で結合して体から排出することにより、金属の毒性を軽減する医療処置です14、15、16、17。 2 つ以上の官能基 -OH、-COOH、-SH、-OCH3、-C=O、-PO3H2、-NR2、-O-、および -S- を適切な配置で含む化合物は、結合できることが示されています。鉄イオン39． カフェインと金属イオンの相互作用は、カフェインの酸素原子および窒素原子を介して発生します。 しかし、N1、N3、N7 原子にメチル基が存在するため、カフェインは O2 原子および O6 原子を介して金属イオンと錯体を形成し 18、そのキレート活性は EDTA と比較してそれぞれ 6%18 または 11%19 と低くなります。 (100%)、第一鉄イオン (Fe2+) の参照キレート剤として使用されます。 この研究では、C8-ジアミノアルキルカフェイン誘導体の構造修飾がキレート活性を高めるかどうかを調べるために、フェロジンベースの比色アッセイを適用しました。 図2Aに示すように、すべての新しいカフェイン誘導体は構造依存的にFe2+をキレート化し、その一部はそれぞれEDTA活性の54〜113%の範囲の高いキレート効率を示します。

(A) 0.1 mg/mL のカフェイン誘導体の第一鉄キレート活性は、標準キレート剤 EDTA の % 活性として表示されます。 結果は平均値 ± 標準偏差として表示されます。 (B) AAPH 誘発酸化性溶血に対する、濃度 0.1 mg/mL のカフェイン誘導体および標準抗酸化剤 Trolox (Tx) の in vitro 保護活性。 RBCを化合物とともにプレインキュベート(20分間)し、60 mM AAPHとともにインキュベート(240分間)した。 結果は、Tx 活性と比較した平均値 ± 標準偏差として表示されます (*P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.001)。 統計的に有意でない差はnsとして示されます。

カフェインのイミドおよびアミド誘導体 (図 1、経路 a) では、誘導体 9、10、15、および 19 で最も高いキレート活性が見られました (EDTA 活性の 89 ～ 113%)。これは (i) に依存します。使用する無水物の種類、および (ii) アルキル鎖の長さ。 これらの誘導体のキレート特性は、シス炭素-炭素二重結合 (9、10、15) またはアミド基 (19) と共役したカルボニル基の存在に起因すると考えられます。 前述の誘導体の O、C、および N 原子は共役系、つまり 9、10、および 15 については 2 つの互変異性 (ケト-エノール) 構造、化合物 19 については 2 つの共鳴構造を形成する可能性があります。さらに、キレート活性は長さとともに増加する可能性があります。アルキルジアミン鎖の。

チアゾリジノンは、窒素と酸素をドナー原子として使用して金属錯体を形成できます40。 チアゾリジノン基を有する誘導体 (化合物 20 ～ 22) のキレート特性は変動します (それぞれ 57、54、および 12%)。 化合物 22 (アルキル鎖 n = 4) の最も低いキレート活性は、2 つの窒素原子が金属配位に関与しており、1 つはチアゾリジノン分子から、もう 1 つは N-アルキル リンカーからのものであることを示しています。 ピロリジンジチオカルバメート部分を含む誘導体 (化合物 23 ～ 25) のキレート効率は 9 ～ 12% であり、カフェインのキレート効率 (11%、19 を参照) と同様です。 この場合、低いキレート活性はおそらく、キサンチン環と導入された部分の好ましくない配置によるものと考えられます。 誘導体 26 ～ 30 (71 ～ 87%) と出発化合物 4 ～ 7 の間で、Fe2+ キレート化活性に差はありませんでした (19 を参照)。 出発化合物分子の追加の構造修飾、特に 2 つのカフェイン分子からなる化合物 30 の場合、鉄キレート活性は増加しません。

Carelli-Alinovi et al. らは、カフェインがリン脂質の非対称性やバンド 3 タンパク質の機能などの RBC 膜を、アミロイド ベータペプチド (1-42) 誘発の酸化的変化から効果的に保護することを示しました 41。 この優れた研究は、アルツハイマー病 (AD) および酸化ストレスに関連するその他の神経変性病態の患者におけるカフェインの保護的役割の仮説を裏付けています。 カフェインは細胞膜の脂質二重層の疎水性領域に優先的に位置しますが、水性環境から自発的に分離することはできません 42。 一方で、カフェインの非常に高い生物学的利用能は in vivo 研究によって判明しており 43、そのためカフェインは薬学における重要なモデル分子となっています。 新しいカフェイン誘導体の細胞保護活性を調査するために、まずヒト赤血球を使用した溶血アッセイでその膜破壊活性を評価しました。 化合物の溶血活性が 5% を超える場合、その化合物は特定の濃度でのさらなる評価から除外されることに注意してください 19、32、44。 0.1 mg/mL の濃度で使用したすべての誘導体について、5% を超える溶血活性は観察されませんでした。つまり、溶血活性の範囲は 1.48% ± 2.35 ～ 3.07% ± 1.82 でした。 さらに、誘導体の RBC 形状に対する修飾効果はありませんでした。 得られた結果により、出発分子の構造修飾 (図 1 を参照) により、非細胞毒性の生体適合性 (血液適合性) 化合物が得られ、細胞保護活性をさらに評価できると結論付けることができました。

親水性 2,2'-アゾビス(2-メチルプロピオンアミジン) 二塩酸塩 (AAPH) の熱分解によって生成されるペルオキシル ラジカル (ROO・) によって誘発される赤血球の酸化的損傷に対するすべての誘導体の細胞保護特性を、0.1 mg の濃度で評価しました。 /mL。 この選択された濃度は、カフェイン 19 およびグラミン誘導体 44 のジアミンおよびポリアミン類似体の特性を評価するために以前に使用されてきました。 誘導体の細胞保護活性を、参照抗酸化剤として使用される Trolox の細胞保護活性と比較しました。 図２Ｂに示すように、誘導体は、構造に依存した様式で、ペルオキシルラジカル（ＲＯＯ・）誘発酸化的溶血からＲＢＣを保護する。 試験した 33 種類の化合物のうち、13 種類が Trolox の活性の 50% を超える細胞保護活性を示しました。 さらに、誘導体 18 および 30 と Trolox の細胞保護活性の間に統計的に有意な差はありませんでした。 一方、誘導体 8、20、23、24 ～ 25 の活性はカフェインで得られた活性と同様で、12% に相当しました (19 を参照)。

カフェインは、それぞれ一段階反応または多段階反応でさまざまな ROS を中和すると報告されています9。 一段階反応を伴うメカニズムには、RAF (ラジカル付加体形成)、SET (単一電子移動)、および HAT (水素原子移動) があります。 対照的に、PCET (陽子結合電子移動) と SEPT (逐次電子陽子移動) は多段階のメカニズムです。 デヴァサガヤムら。 は、カフェインがさまざまな ROS によって引き起こされる膜脂質の過酸化を、それぞれヒドロキシルラジカル (・OH)、一重項酸素 (1O2)、ペルオキシルラジカル (ROO・) の順序で阻害することを示しました 7。 さらに、SETメカニズムを介したカフェインのOH消去活性が提案されています45。

私たちの研究では、新たに合成されたカフェイン誘導体が、AAPHから生成されるペルオキシルラジカルを効果的に捕捉し、C-8位の置換基の存在によりRBCを保護することがわかりました。これは、HAT、SET、またはRAF機構によって説明できます。 ガラノら。 らは、-NH-COCH3 などの電子供与基の存在により SET 機構の効率が低下する一方、NO2 などの電子求引基の存在により SET 機構の効率が増加することを示しました。 RAF メカニズムは、複数の結合を持つ抗酸化物質として特徴付けられます 46。 NH アミド基を持つ誘導体 17 ～ 19 は、HAT 機構を使用してペルオキシル ラジカルと効率的に反応できる最も効率的な水素原子供与化合物です。 化合物 26 ～ 30 の活性はおそらく、電子が豊富な不飽和結合によるものであり、これによりラジカルの形成やペルオキシル ラジカルの付加のための電子供与体として反応することが可能になります。 さらに、不飽和共役結合の存在によりラジカルの転位が促進されます。 不飽和結合が存在するため、誘導体 26 ～ 30 は RAF メカニズムを使用してペルオキシル ラジカルを首尾よく中和できます。 さらに、誘導体 26 ～ 29 の場合、電子吸引基の存在により、RAF 機構が SET 機構と競合する可能性があります。 さらに、化合物 17 ～ 19 および 26 ～ 29 は、よく知られた天然の抗酸化物質であるビタミン E (トコフェロール) に構造的に似ています。 これらの誘導体とビタミン E は、外部に分岐したアルキル鎖を持つ二環系を持っています。 この分子の「極性頭部-非極性尾部」構造により、RBC膜の脂質二重層との相互作用が促進されます。 我々は以前、「極性頭部・非極性尾部」分子と脂質二重層との相互作用が赤血球膜の安定性を高め、その結果、ROS44に対する赤血球保護を強化できることを示した。 したがって、化合物 18 (構造的にビタミン E に類似) の最も高い細胞保護活性は、(i) 適切なアルキル鎖長による細胞膜との相互作用、および (ii) 直接的な ROS 消去活性によってそれぞれ説明できます。 化合物 30 の電子供与能力は、アルキル鎖で結合された 2 つのカフェイン分子の存在によって裏付けられていると考えられます (図 1 を参照)。

最も高い細胞保護活性を持つ選択された誘導体 (9、18、26、27、29、30) を使用して、細胞抗酸化アッセイ (CAA) における RBC 内の AAPH 誘発酸化ストレスに対するそれらの効果を研究しました 47,48。 このアッセイでは、膜透過性疎水性蛍光酸化還元プローブ 2',7'-ジクロロジヒドロフルオレセイン ジアセテート (DCF-DA) が細胞エステラーゼによって脱アセチル化され、RBC 内にトラップされます。 その後、DCF は ROS 依存性の酸化を受け、ROS レベルに依存する蛍光強度を持つ蛍光型に変換されます。 図 3 はヒストグラムを示し、研究したサンプルのフローサイトメーターから得られた平均蛍光強度 (MFI) 値を示しています。 予想通り、PBS バッファー中でインキュベートしたコントロール RBC で最も低いレベルの ROS が検出され (図 3A、E)、AAPH とインキュベートした RBC で最も高レベルでした (図 3D、E)。 図 3E に示すように、選択したすべての誘導体は構造依存的に RBC 内の ROS レベルを低下させましたが、標準の抗酸化剤 Trolox が最も効果的でした (図 3B と C も比較)。 結果に基づいて、選択されたすべての誘導体は RBC 膜を通過し、構造に依存した方法で RBC 内の ROS を除去すると結論付けることができます。

ヒト赤血球における 60 mM AAPH (1.5 時間、37 °C) によって生成された ROS レベルでの選択されたカフェイン誘導体の阻害活性は、DCF 平均蛍光強度 (MFI) として推定されます。 代表的なフローサイトメトリーのヒストグラムを示します: (A) PBS、ネガティブコントロール、(B) 誘導体 27 + AAPH、(C) Trolox、参照抗酸化剤、+ AAPH、(D) AAPH、ポジティブコントロール、(E) 平均蛍光強度 (試験サンプルおよび派生サンプルについて得られた、RBC 中の DCF の MFI) 値 (± SD、n = 6)。

赤血球の生体超共焦点分析は、フローサイトメトリー測定と同時に実行されました。 予想どおり、DCF 負荷 RBC の蛍光強度は、AAPH サンプル (図 4B) と比較して、誘導体 18 (図 4C) および標準抗酸化物質 Trolox (図 4D) の存在下で大幅に減少しました。 RBC の形状はほとんどが円板状でした (図 4A ～ C)。 しかし、ウニ状細胞は Trolox の存在下で観察されました (図 4D)。 ここで、RBC は循環系の血流特性を最適化するために人体の中で最も変形しやすい細胞であり、RBC の形状の口球細胞-円板細胞-棘細胞 (SDE) の変換は、生体内および生体内両方でよく説明されている現象であることに注意する必要があります 49インビトロ50。 したがって、この in vitro 研究で観察されたヒト RBC の円板状および斑点状の形状は生理学的です。

共焦点顕微鏡における蛍光酸化還元プローブ DCF-DA (10 μM、30 分、37 °C) による ROS レベルの超生体可視化: (A) コントロール RBC (PBS)、(B) 60 mM AAPH (2 時間)、(C)誘導体 18 (0.1 mg/mL、20 分間プレインキュベーション) + 60 mM AAPH (1.5 時間)、(D) Trolox (0.1 mg/mL、20 分間プレインキュベーション) + 60 mM AAPH (1.5 時間)。 上のパネル - 蛍光画像、中央のパネル - 透過光画像、下のパネル - 蛍光画像と透過光画像を組み合わせたものです。 一連の実験の代表的な画像を示します。 スケールバー = 10 μm。

ヘモグロビン (Hb) は、酸素輸送の機能を実行する赤血球の主要なタンパク質です。 生理学的条件下では、Hb の自動酸化によりヘム鉄が鉄(III) に酸化された少量のメトヘモグロビン (MetHb) が継続的に生成されます51。 MetHb は、ニコチンアミドアデニン ジヌクレオチド (NADH) 依存性シトクロム b5 レダクターゼによって Hb に変換されます。 しかし、ROS レベルが上昇すると、抗酸化システムが無効になり、組織への酸素輸送が損なわれ、虚血が引き起こされます。 Hb 酸化に対する選択的誘導体の保護効果を調査するために、Hb のスペクトル スキャン (450 ～ 700 nm) が実行されました。 対照サンプル (PBS バッファー) では、オキシヘモグロビンは 540 および 570 nm の 2 つのピーク (図 5、赤線) によって特徴づけられ、630 nm にピークを示す MetHb は存在しません。 AAPH を含むサンプルでは、​​oxy-Hb のピークが減少し、MetHb に特有のピークが現れます (図 5、緑色の線)。 誘導体 27 の存在下では、AAPH サンプルと比較してオキシ-Hb ピークに変化はありませんが、MethHb ピークは吸光度値 0.052 から 0.033 に減少しました (図 5、青線) (図 5 の表を参照)。 5)。 結論として、誘導体 27 は Hb を MetHb 形成から保護しました (図 5)。

RBC を PBS (赤線)、60 mM AAPH (緑線)、誘導体 27 (0.1 mg/mL) および 60 mM AAPH (青い線）。 540、578 (オキシ-Hb ピーク)、および 630 nm (MetHb ピーク) で測定された吸光度値 (Ab) がスキャンごとに表示されます。 一連の実験の代表的なデータが示されています。

ハインツ小体は、酸化または変性した Hb から形成されるヘミクロムの RBC 封入体であり、最も一般的には古い赤血球、またはグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ (G-6-PD) 欠損症や不安定な Hb 疾患などの特定の病状で発生します 52。 天然のフェノール化合物であるアリルピロカテコールなど、細胞膜を通過する能力のある抗酸化物質は、AAPH 由来のフリーラジカルとインキュベートされた赤血球におけるハインツ小体の形成を大幅に減少させることができます 53。 光学顕微鏡分析により、選択された誘導体、すなわち誘導体２７が、ＡＡＰＨ誘発酸化ストレス下でのハインツ小体の形成を減少させることが示された（図６）。 誘導体 27 による Hb 酸化の阻害は、その高い血液保護効果を裏付けています。

光学顕微鏡によるメチルバイオレット（0.5％、45分、37℃）で染色したRBC中のハインツ小体の生体超可視化：（A）コントロールRBC（PBS）、（B）60mM AAPH（4時間）。 (C) 誘導体 27 (0.1 mg/mL、20 分間のプレインキュベーション) + 60 mM AAPH (4 時間)。 (D) Trolox (0.1 mg/mL、20 分間のプレインキュベーション) + 60 mM AAPH (4 時間)。 (B) および (C) には、RBC 膜の隣に小さな染色された顆粒として見えるハインツ小体を含む RBC の拡大図が挿入されています。 一連の実験の代表的な画像が表示されます。 スケールバー = 10 μm。

要約すると、さまざまなアッセイを使用して得られた結果は、選択された C-8 置換カフェイン誘導体が：（i）効果的な第一鉄イオンキレート剤、（ii）生体適合性があり細胞膜を通過する化合物であり、（iii）赤血球膜とヘモグロビンを効果的に保護することを示しました。 ROS による損傷。

インシリコ法は、化合物の薬剤としての可能性を検証するための最も効果的なツールの 1 つであり、ADME プロファイル (吸収、分布、代謝、排泄) を予測する機会を提供します。 研究したすべての化合物の物理化学的特性は、SwissADME Web サーバーを使用して計算されました。

表 1 からわかるように、新しく得られた化合物はすべてカフェインよりも親油性が高いことがわかります。 log P 値が 1 ～ 3 の新しいカフェイン誘導体のほとんどは、細胞膜の脂質二重層を通過できる良好な親油性を備えています。 最も高い log P 値は、キサンチン部分の C-8 に不飽和アルキル置換基を含む化合物 (化合物 26 ～ 29) で観察されます。 一般に、アルキル側鎖が長いほど分配係数は高くなります。 化合物 29 は、試験したすべての化合物の中で最も親油性が高い (log P 4.36)。 さらに、ほとんどの化合物は「5 の法則」の基準 (HB ドナーが 5 未満、HB アクセプターが 10 未満、分子量 < 500、計算された log P < 554) を満たしており、抗酸化物質として有望です。 前述したように、カフェイン分子は細胞膜の疎水性部分に優先的に位置します42。 したがって、2つのカフェイン分子を有する誘導体30は、脂質二重層の疎水性部分とより効率的に相互作用し、その結果、フリーラジカルによる損傷に対して分子膜構造を安定化させる可能性がある。 さらに、化合物 26 ～ 30 は水素結合アクセプターとして、水素結合を通じて細胞膜成分と効果的に相互作用することができ、ROS-RBC 膜相互作用を防止または遅延させることができます。 カフェインが最も広く消費されている中枢神経系興奮剤であるという周知の事実にもかかわらず 55、その選択された C8 置換誘導体は、神経変性疾患の予防または治療において効果的な抗酸化剤および細胞保護剤として作用する可能性があります。

カフェインは、よく知られており、最も一般的に消費される精神活性化合物の 1 つです。 毎日のカフェイン摂取は、加齢とともに進行する認知機能の低下や認知症を防ぐ食事の一部である可能性があります。 したがって、私たちの研究の主題は、モデル細胞としてのヒト赤血球におけるカフェインの抗酸化作用および細胞保護作用に対するカフェインの構造修飾の影響を調査することでした。

我々の結果は、生体適合性 C8 置換カフェイン誘導体の構造と、(i) 第一鉄イオンを錯体化し、(ii) 酸化ストレスの有害な影響からヒト赤血球を保護する能力との間に有意な関係があることを示しました。 化合物 9、10、15、および 19 の最も高いキレート活性は、第一鉄イオンと錯体を形成できる -OH 基との互変異性構造または共鳴構造の存在に起因すると考えられます。 誘導体の抗酸化能力を説明するために、SET、RAF、および/または HAT、およびラジカル安定化のメカニズムが提案されています。 NH アミド基を持つ誘導体 17 ～ 19、およびラジカル再配置を促進する不飽和共役結合を持つ誘導体 26 ～ 30 は、ヒト赤血球において高い保護活性を示しています。 誘導体 17 ～ 19 は HAT 機構によってペルオキシル ラジカルを中和し、誘導体 26 ～ 30 は RAF 機構によって中和します。 さらに、派生 26 ～ 29 の場合、RAF メカニズムは SET メカニズムと競合する可能性があります。 さらに、誘導体 18 および 30 の高い細胞保護活性は、それぞれ水素結合を介して細胞膜の疎水性領域および/または親水性領域と相互作用できる特異的な両親媒性構造に関連している可能性があります。 誘導体と細胞膜の相互作用により細胞膜が安定化し、膜成分とヘモグロビンの両方を ROS 誘発酸化から保護します。

要約すると、インビトロとインシリコの両方で得られた我々の結果は、鉄キレート化とヒト赤血球膜との特異的相互作用が、選択されたC-8置換カフェイン誘導体の優れた細胞保護特性の原因であることを示しています。 新たに得られた生体適合性カフェイン誘導体のほとんどはリピンスキーの 5 の法則を満たすため、さらなる構造修飾に使用して、有益な薬理学的特性を持つカフェインベースの細胞保護化合物の構造と活性の関係についての知識を広げることができます。

すべての出発物質は Sigma-Aldrich から入手し、精製せずに使用しました。 プロトン (1H) および炭素 (13C) NMR スペクトルは、溶媒として DMSO-d6、内部標準として TMS を使用し、300 および 75 MHz で動作する Varian Gemini 300/400 分光計で記録しました。 化学シフトはδ (百万分率) で報告されます。 FTIR スペクトルは Nicolet iS5 分光計 (KBr ペレット) で記録しました。 EI質量スペクトルは、320-MS/450 GC質量分析計(Bruker)で測定した。 融点は、SMP-20装置(BŰCHI Labortechnik AG)を用いて測定した。 分析用薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）は、シリカゲルプレート６０ Ｆ２５４（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）上で実施した。 TLC での検出は UV 光によって行われました。

化合物 1 ～ 7 の合成については、以前の論文で説明しました 19。

適切な 8-ジアミノカフェイン誘導体 1 ～ 3 (1 mmol) と適切な無水物 (1 mmol) の酢酸 (10 mL) 混合物を 1 ～ 15 時間加熱還流し、室温まで冷却しました。 得られた混合物をCH2Cl2で抽出し、MgSO4で乾燥させた。 溶液を蒸発させた後、粗生成物8-19をCHCl3から再結晶させた。

適切なジアミノカフェイン類似体の溶液に、酢酸 (97% 水溶液、10 mL) 中の 1-3 (1 mmol) を、塩化 2-クロロアセチルの溶液 (97% 水溶液、0.08 mL、1 mmol) に滴下して加えました。 。 反応混合物の温度が４０℃に達したら、蒸留水（８ｍＬ）中の酢酸ナトリウム（３２０ｍｇ、１ｍｍｏｌ）を加えた。 反応混合物を40～60℃の温度で8時間撹拌した。 反応混合物を室温まで冷却し、CHCl3 (3 x 20 mL)で抽出した。 合わせた有機層をMgSO4で乾燥し、減圧下で蒸発させて油を得た。

適切なカフェイン誘導体 (1a、2a、または 3a) (1 mmol) とチオシアン酸アンモニウム (76.12 mg、1a の場合は 1 mmol、152.24 mg、2a および 3a の場合は 2 mmol) のエタノール (10 mL) 混合物を還流下で加熱しました。 22 ～ 43 時間放置し、室温まで冷却します。 溶液を蒸発させて油を得た。

適切なカフェイン誘導体 (1a、2a、または 3a) (1 mmol) とピロリジンジチオカルバミン酸ナトリウム (338.48 mg、2 mmol) のエタノール (10 mL) 混合物を還流下で 33 ～ 40 時間加熱し、室温まで冷却しました。 。 溶液を蒸発させて油を得た。

無水エタノール (5 mL) 中の 4-ニトロチオフェン-2-カルボン酸メチル (1 mmol; 187 mg) の懸濁液を磁気撹拌しながら 40 ℃ に加熱し、硝酸銀 (1 mmol; 170 mg) を加えました。 15分後、適切なカフェインジアミン誘導体4～7(1mmol)を導入し、反応混合物を還流下で20時間加熱し、磁気撹拌下で3日間保持した。 次いで、それを室温まで冷却し、水(10mL)で希釈した。 水相をCH2Cl2(3×30mL)で抽出し、MgSO4で乾燥させた。 有機溶媒を減圧下で蒸発させて粗生成物を得、これを石油エーテルから結晶化させた。

無水エタノール (5 mL) 中の 3,4-ジニトロチオフェン (1 mmol; 174 mg) の懸濁液を磁気撹拌しながら 40 ℃ に加熱しました。 １５分後、８−（メチル（２−（メチルアミノ）エチル）アミノ）カフェイン（２ｍｍｏｌ；５６８ｍｇ）を導入し、反応混合物を還流下で２０時間加熱し、磁気撹拌下で３日間保持した。 反応混合物を室温まで冷却し、水(10mL)で希釈した。 水相をCH2Cl2(3×30mL)で抽出し、MgSO4で乾燥させた。 有機溶媒を減圧下で蒸発させて残留物を得、粗生成物を石油エーテルから結晶化させた。

第一鉄イオン（Fe2+）キレート活性は、試験化合物をFe2+とインキュベートした後のFe2+-フェロジン錯体の形成を阻害することによって評価した。 試験化合物の Fe2+ キレート能力は、室温 (約 22 °C、RT) での 562 nm での第一鉄イオン - フェロジン錯体の吸光度によって決定されました。 簡単に説明すると、0.2 mLのエチルアルコール中の0.1 mg/mL濃度の試験化合物を0.6 mM FeCl2の溶液（0.05 mL）に添加した。 EDTA を標準金属キレート剤として使用しました。 エチルアルコール中の５ｍＭフェロジン（０．０５ｍＬ）を添加し、直ちに激しく振盪することによって反応を開始した。 サンプルは室温で 10 分間保存されました。 インキュベーション後、溶液の吸光度 (Abs) を BioMate™ 160 UV-Vis 分光光度計で 562 nm で測定しました。 フェロジン – Fe2+ 錯体形成の阻害率は、次の方程式を使用して計算されました。

ここで、Abs0 は試験化合物を含まないサンプルの吸光度、Abs1 は試験化合物の存在下での吸光度です。 各サンプルは 3 つずつ作成され、3 つの独立した実験が実行されました。

すべての方法は関連するガイドラインと規制に従って実行され、生命倫理委員会はポズナン医科大学での科学研究のためのすべての実験プロトコルを承認しました（契約番号 ZP/907/1002/18）。 ヒト赤血球濃縮物は、献血者との接触なしにポズナンの血液銀行から購入されました。 すべての献血者からインフォームドコンセントを得た。

新鮮なヒト RBC 懸濁液 (ヘマトクリット 65%) を 7.4 pH リン酸緩衝生理食塩水 (PBS - 137 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na2HPO4、1.76 mM KH2PO4) で 3 回洗浄しました (3000 rpm、10 分、+4 °C)。 10 mM グルコースを補充しました。 洗浄後、細胞を 1.65 × 109 細胞/mL (ヘマトクリット 15%) で PBS バッファーに懸濁し、4 °C で保存し、5 時間以内に使用しました。

溶血活性は以前に報告されているように評価されました19。 簡単に説明すると、RBC (1.65 × 108 細胞/mL、ヘマトクリット 1.5%) を、10 mM グルコースを補充し、0.1 mg/mL に等しい濃度で試験した化合物を含む PBS (pH 7.4) 中で、37 °C で振盪しながら 60 分間インキュベートしました。インキュベータ。 この研究で使用された誘導体の濃度は、我々の以前の研究に従って選択されました19,44。 試験化合物を含まないＰＢＳ中でＲＢＣをインキュベートしたサンプルを対照サンプルとして採取した。 各サンプルを 3 回繰り返し、異なるドナーからの RBC を使用して実験を 4 回繰り返しました。 インキュベーション後、RBC 懸濁液を遠心分離し (3000 rpm、10 分間、+4 °C)、BioMate™ 160 UV-Vis 分光光度計で λ = 540 nm で上清の吸光度を測定することによって溶血の程度を推定しました。 結果は溶血のパーセンテージ (%) として表されました。 溶血０％は、ＰＢＳ緩衝液中のＲＢＣ懸濁液の上清の吸光度とみなし、一方、全溶血（１００％）は、ＰＢＳを氷冷蒸留水に置き換えたときに決定した。 溶血度 < 5% は、化合物の溶血活性がないことを示します。

０．１ｍｇ／ｍＬの濃度の化合物とインキュベートした後、ＲＢＣを５％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）＋０．０１％グルタルアルデヒド（ＧＡ）中で室温で１時間固定した。 固定されたＲＢＣは、上清をＰＢＳと交換することによって洗浄された。 洗浄後、ＲＢＣをポリ−１−リジン処理（０．１ｍｇ／ｍＬ、室温で１０分間）したカバーガラス上に沈降させ、８０％グリセロール上に載せた。 カバースリップをマニキュアで密封した。 いくつかの別々の実験サンプル中の多数の細胞を、Zeiss LSM 510 (AXIOVERT ZOOM) 共焦点顕微鏡 (Carl Zeiss Microscopy、オーバーコッヘン、ドイツ) (100 ×/1.4 口径液浸油対物レンズ、10 × 接眼レンズ) を使用して研究しました。 画像は、Zeiss LSM Image Browser プログラム (Carl Zeiss Microscopy、オーバーコッヘン、ドイツ) を使用して取得しました。

誘導体の細胞保護活性は、以前に記載された方法に従って評価されました44。 簡単に説明すると、RBC (1.65 × 108 細胞/mL、1.5% ヘマトクリット) を、試験化合物または標準抗酸化剤として使用される Trolox を 0.1 mg/mL の濃度で含む 10 mM グルコースを添加した PBS (pH 7.4) 中で 20 分間プレインキュベートしました。振盪インキュベーター内で 37 °C で。 誘導体の濃度は、我々の以前の研究に従って選択されました19,44。 プレインキュベーション後、2,2'-アゾビス(2-メチルプロピオンアミジン)二塩酸塩 (AAPH) を最終濃度 60 mM で添加し、サンプルを次の 4 時間インキュベートしました。 PBS中でインキュベートした赤血球およびAAPHとともにインキュベートした赤血球を、それぞれ陰性および陽性対照として採用した。 インキュベーション後、RBC 懸濁液を遠心分離し (3000 rpm、5 分、+4 °C)、BioMate™ 160 UV-Vis で λ = 540 nm で上清の吸光度 (Abs) を測定することによって溶血の程度を決定しました。分光光度計。 ROS 誘発溶血阻害のパーセンテージは、次の式を使用して計算されました。

ここで、Abscomp は AAPH の存在下で試験した化合物とインキュベートしたサンプルから得られた上清の吸光度、AbsPBS はネガティブ コントロールから得られた上清の吸光度、AbsAAPH はポジティブ コントロールから得られた上清の吸光度です。 各サンプルは 3 回作成され、結果は異なるドナーから得られた RBC を用いた 3 回の独立した実験の平均値 (± SD) として表示されます。

以前に報告されたように、ROS レベルが検出されました 48。 簡単に言うと、酸化還元蛍光プローブ 2',7'-ジクロロジヒドロフルオレセイン ジアセテート (DCF-DA) (Sigma-Aldrich D6883) を使用して、無傷の RBC における ROS レベルを推定しました。 選択した誘導体または Trolox (上記のとおり) とプレインキュベートし、60 mM AAPH (1.5 時間、37 °C) とインキュベートした RBC を洗浄し (3000 rpm、5 分、+4 °C)、その後 DCF-DA と 4 ℃でインキュベートしました。最終濃度 10 μM、37 °C、暗所で 30 分間。 DCFDA をロードした RBC (100 μl) を 1000 μL PBS に再懸濁し、すぐにフローサイトメーター Cytomix FC 500 で RBC 中の ROS 依存 DCF 蛍光強度を励起波長 488 nm および発光波長 530 nm で測定しました。 MPL（ベックマン・コールター）。 結果はヒストグラムと平均蛍光強度 (MFI) の値として表示されました。

フローサイトメトリー分析用に調製した RBC (上記と同様) を洗浄し (3000 rpm、5 分、+4 °C)、ポリ-L-リジン処理 (0.1 mg/mL、10 分、RT) したカバーガラス上に静置し、マウントしました。 80％グリセロール。 直ちに、Zeiss LSM 510 (AXIOVERT ZOOM) 共焦点顕微鏡 (Carl Zeiss Microscopy、オーバーコッヘン、ドイツ) (100 ×/1.4 口径液浸油対物レンズ、10 × 接眼レンズ) を使用し、励起波長 488 nm で生細胞を分析しました。発光波長は530nm。 画像は、Zeiss LSM Image Browser プログラム (Carl Zeiss Microscopy、オーバーコッヘン、ドイツ) を使用して取得しました。

ヘモグロビンの吸収スペクトルは、「酸化ストレス誘発溶血の阻害」のセクションで得られた選択されたサンプルから得られた上清を使用して、BioMate™ 160 UV-Vis 分光光度計で 450 ～ 700 nm の可視範囲でスキャンされました。 「酸化ストレス誘発溶血の阻害」のセクションで選択したサンプルから得た RBC を、ハインツ小体の細胞内視覚化に使用しました。 細胞をメチルバイオレット(0.9% NaCl中0.5%)で室温で45分間染色した。 インキュベーション後、ＲＢＣを洗浄し、５％ＰＦＡ＋０．０１％ＧＡ中で室温で１時間固定した。 固定されたＲＢＣは、上清をＰＢＳと交換することによって洗浄された。 洗浄後、ＲＢＣをポリ−１−リジン処理（０．１ｍｇ／ｍＬ、１０分間、室温）したカバーガラス上に沈降させ、８０％グリセロール上に載せた。 カバースリップをマニキュアで密封した。 RED-233 MOTIC 顕微鏡 (63 x/1.4 口径、10 x 接眼レンズ) を使用して、いくつかの別々の実験サンプル中の多数の細胞を研究しました。 画像は Motic Images Plus 3.0 を使用して取得されました。

試験したすべての化合物の物理化学的特性は、SwissADME Web サーバー (www.swissadme.ch) を使用して計算されました。

抗酸化特性および細胞保護特性については、データを 3 回の各サンプルでの 3 回または 4 回の独立した実験の平均 ± SD としてプロットしました (n = 9)。 対応のある t-Student 検定を使用して、誘導体の活性と標準的な抗酸化物質 Trolox の活性を比較しました。 統計的有意性は P < 0.05 として定義されました。 統計的に有意な差はnsとして示されませんでした。

現在の研究中に使用および/または分析されたデータセットは、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。

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この研究は、ポズナンのアダム・ミツキェヴィチ大学化学科の研究補助金と、ポズナンのアダム・ミツキェヴィチ大学生物学部細胞生物学科の法定活動番号 S/PB/004 によって財政的に支援されました。 ニトロチオフェンの開環反応を行う機会を与えてくださったジェノヴァ大学 (イタリア) の Giovanni Petrillo 教授に感謝いたします。

ウカシュ・ピオシク氏が亡くなった。

ポズナンのアダム・ミツキェヴィチ大学化学部生物活性製品学科、Uniwersytet Poznańskiego 8、61-614、ポズナン、ポーランド

アルレータ・シェラコウスカ & ベアタ・ヤシェヴィチ

ポズナンのアダム・ミツキェヴィチ大学生物学部細胞生物学科、Uniwersytet Poznańskiego 6、61-614、ポズナン、ポーランド

ウカシュ・ピオシク & ルシナ・ムロフチンスカ

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概念化、BJ と LM。 調査、AS、Ł.P.、LM。 執筆 - 原案の準備、AS、Ł.P.、BJ、LM。 執筆 - レビューと編集、AS、BJ、LM。 資金調達、BJ、LM。 すべての作成者が最終バージョンを承認しました。

ベアタ・ヤシェヴィチまたはルシナ・ムロフチンスカへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

シュプリンガー ネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

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転載と許可

シェラコウスカ、A.、ヤシェヴィチ、B.、ピオシク、Ł. 他。 ヒト赤血球における有望な抗酸化剤および細胞保護剤としての新しい C8 置換カフェイン誘導体。 Sci Rep 13、1785 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-022-27205-8

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受信日: 2022 年 9 月 19 日

受理日: 2022 年 12 月 28 日

発行日: 2023 年 1 月 31 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-27205-8

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