Dimocarpus longan ポリフェノールオキシダーゼの生化学的特性評価により、その触媒効率についての洞察が得られます

Scientific Reports volume 12、記事番号: 20322 (2022) この記事を引用

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熱帯のリュウガンの木から作られる「ドラゴンアイ」の果実には、栄養素と抗酸化物質が豊富に含まれています。 これらは、主にポリフェノールオキシダーゼ (PPO) ファミリーの酵素が関与するプロセスである、収穫後の酵素による褐変に悩まされています。 この研究では、PPO をコードする 2 つの cDNA が Dimocarpuslongan (Dl) の葉からクローン化され、大腸菌で異種発現され、アフィニティークロマトグラフィーによって精製されました。 プレプロ-DlPPO1 は、葉緑体間質およびチラコイド内腔へのタンパク質の輸送を促進する 2 つのシグナルペプチドをその N 末端に含んでいます。 プレプロ-D1PPO1 から 2 つのシグナルペプチドを除去すると、プロ-D1PPO1 が得られます。 プレプロ-DlPPO1はプロ-DlPPO1よりも高い耐熱性を示し(65℃対40℃で展開)、シグナルペプチドがDlPPO1のフォールドを安定化させる可能性があることを示唆している。 DlPPO1 は、モノフェノール基質とジフェノール基質の両方を受け入れるため、チロシナーゼとして分類できます。 pro-DlPPO1 は、天然ジフェノール (-)-エピカテキン (kcat/KM 800 ± 120 s-1 mM-1) に対して最も高い特異性を示し、これは 4-メチルカテコール (590 ± 99 s-1 mM-1) よりも高かった。 1)、ピロガロール (70 ± 9.7 s-1 mM-1) およびカフェ酸 (4.3 ± 0.72 s-1 mM-1)。 プレプロ-DlPPO1 の速度論的効率は、前述の 4 つのジフェノール基質についてプロ-DlPPO1 で観察された効率よりもそれぞれ 23、36、1.7、および 4.7 倍低い。 さらに、ドッキング研究では、(-)-エピカテキンの結合エネルギーが他のどの基質よりも低いことが示されました。 反応速度論的研究とインシリコ研究の両方が、(-)-エピカテキンが DlPPO1 の優れた基質であることを強く示唆しており、特定のフラボノイド化合物に対する PPO の親和性を確認しています。

ポリフェノールオキシダーゼ (PPO) は、細菌 1、真菌 2,3、古細菌 4、植物 5、昆虫 6,7、およびヒトを含む動物 8,9 に存在する III 型二銅金属酵素です。 PPO ファミリーには、チロシナーゼ (TYR) 10、11、12、13 およびカテコー​​ル オキシダーゼ (CO) 14、15 が含まれます。 TYR は、モノフェノールの o-ジフェノールへのオルト水酸化 (モノフェノラーゼ活性、EC 1.14.18.1) と、その後の対応する o-ジフェノールの o-キノンへの酸化 (ジフェノラーゼ活性、EC 1.10.3.1) を触媒しますが、CO は機能することしかできません。後者のジフェノラーゼ活性13,16。 得られるキノンは反応性の高い化合物であり、非酵素的に急速に重合し、それによってメラニンとして知られる黄色から黒色の複合色素を形成します17、18。

生体内では、植物 PPO は前駆体タンパク質 (プレプ​​ロ PPO) として翻訳され、これは約 60 ～ 75 kDa の約 600 アミノ酸の翻訳に相当します 19,20。 プレプロ PPO には 3 つの異なるドメインが含まれます。 N 末端シグナル配列、Cu-Cu 部位を持つ触媒活性ドメイン、および活性ドメインを遮蔽する C 末端ドメイン 5,20,21 (図 S1)。 シグナル配列 (約 80 ～ 100 アミノ酸) は、タンパク質自体が切断されながら、タンパク質を細胞内の目的地に導きます 22,23。 チラコイド膜を通過した後、残りのパッセンジャータンパク質は潜在型 (プロ型) に加工され、一般に 45 ～ 69 kDa であると報告されています 14。 各銅が活性ドメインに位置する 3 つのヒスチジン残基によって個別に配位されている二核銅中心は、C 末端ドメインによって保護されたままであり、候補基質への活性部位の露出を効果的に防ぎます。 C 末端ドメインが活性部位から切り離されると、潜伏期間は解除されます。 インビトロでは、この破壊はプロテアーゼ（トリプシン、プロテイナーゼ K など）25、酸性または塩基性 pH24、脂肪酸 26、人工界面活性剤（ドデシル硫酸ナトリウム、SDS など）17、27、28、29、30、31 の影響を受ける可能性があります。 32、33。 天然のタンパク質分解機構は不明であるが 17、植物 PPO は自己タンパク質分解によって活性酵素を C 末端ドメインから分離できる自己活性化能力があることが最近報告されている 34、35、36。

リュウガン (Dimocarpus longan、Dl) はムクロジ科ムクロジ科に属し、東南アジアの亜熱帯地域が原産です 37,38。 果実にはいくつかの栄養成分が豊富に含まれており、特に果皮には、(-)-エピカテキン、4-メチルカテコール、ピロガロール、カフェ酸、没食子酸、ケルセチン、バニリン酸、フェルラ酸などのフェノール化合物が多量に含まれています39,40,41。図 S2) は、強力な抗炎症作用、抗酸化作用、抗がん作用を示します 42,43。 フェノール化合物から得られる健康上の利点にもかかわらず、リュウガンの果皮は周囲温度下で収穫後 2 ～ 3 日で急速に劣化し、茶色に変色する可能性があります44。 結果として生じる茶色の複合体の存在は、果実の品質を大幅に低下させます。 リュウガンの保存寿命を延ばすために、殺菌剤の浸漬、ワックス、キトサンコーティング、硫黄燻蒸などの物理的アプローチが適用されてきました45、46、47、48、49。 しかし、褐変反応は依然としてリュウガン産業の主な問題となっている47。 PPO は、多くの農産物における収穫後の褐変の主な原因として広範囲に調査されています11、12、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61が、報告はわずかしかありません。リュウガン PPO62、63、64 の生化学的特性について入手可能です。 酵素は天然源から抽出され、硫酸アンモニウム沈殿とその後のカラムクロマトグラフィー (セファデックス G-200 およびフェニル セファロース) または透析によって精製されました 62,63。 抽出されたリュウガン PPO の最適 pH と温度は、それぞれ 6.5 と 35 °C であると報告されています 62。 この酵素は、ピロガロール、4-メチルカテコール、およびカテコー​​ルに対して活性でした。 さらなる報告では、(-)-エピカテキンがlongan63の最適な内因性基質であると記載されています。 リュウガン PPO 遺伝子もクローン化されました 64 が、異種発現はされていません。 リュウガン PPO の酵素分類は依然として不明であり、フェノール基質に対するその特異性と反応速度論的効率はこれまで十分に研究されていません。

ここでは、PPO 遺伝子を含む 2 つの cDNA が Dimocarpus longan の葉からクローン化されました。 プロＤＩＰＰＯ１は潜在型をコードし、一方、プレプロＤＩＰＰＯ１は、そのタンパク質配列中にＮ末端シグナル配列をさらに含む潜在型の前駆体をコードする。 このシグナル配列は、葉緑体間質への輸送を促進する輸送ペプチドと、タンパク質の最終目的地としてチラコイド内腔を指定するチラコイド輸送シグナルから構成されます65。 通常、植物シグナルペプチドは細菌には認識されません。 配列全体がタンパク質に翻訳されますが、シグナルペプチドが細菌によって適切に処理されないため、発現中にタンパク質全体が凝集する可能性があります。 この研究では、プレプロ PPO が原核生物系で初めて発現に成功し、均一に精製され、類似のプロ酵素と比較して生化学的に分析されました。 両方の変異体のフェノール基質に対する速度論的特性が評価されています。 速度論的に特徴付けられた基質は、天然基質 ((-)-エピカテキン、4-メチルカテコール、カフェ酸、ピロガロール) (図 S2) と標準基質 (チラミン、チロシン、ドーパミン、l-DOPA) (図 S3) の 2 つのグループに分類されました。 。 天然基質とは、HPLC によってリュウガン抽出物中に以前に検出されたフェノール化合物を指します 39,40,41。一方、標準基質は PPO の特徴付けに一般的に使用されるものです 3,17,66,67,68 (リュウガン果実に存在する場合と存在しない場合があります)。 さらに、DlPPO1 のモデル構造を適用したドッキング研究を使用して、酵素と基質の相互作用を調査しました。 本研究は、DlPPO1 に対するシグナル配列の存在の生化学的影響を解明することを目的とし、DlPPO1 の収穫後の褐変を改善するための新しい持続可能な方法を考案するために必要な、DlPPO1 の基質受容性と特異性に関する基本的な情報を提供することを目的として計画されました。商業的に重要なトロピカルフルーツ。

プレプロ-DlPPO1およびプロ-DlPPO1のORFを囲むプライマーを用いたD.ロンガンの相補的DNA上のPCR産物は、それぞれ約1800bpおよび1500bpの異なるバンドを生じた(図S4)。 pGEX-6P-SG ベクター 69 へのクローニング後、サンガー配列決定により、プレプロ DlPPO1 が 1797 ヌクレオチドの ORF で構成され、公開されている DlPPO1 から推定されるアミノ酸配列と 100% 同一である 599 個のアミノ酸をコードしていることが確認されました ( Uniprot エントリ: A0A0K0NPU9)64。 pro-DlPPO1 は、503 アミノ酸をコードする 1512 ヌクレオチドの ORF を含み (表 S1)、5 つの変更されたアミノ酸 (Pro46Arg、Glu226Asp、Gln451His、Ile455Met、および Asn486Tyr、図 S5) から生じる以前に公開された DlPPO1 配列 64 と 99.60% の同一性を持っています。 。 プロ-DlPPO1 酵素とプレプロ-DlPPO1 酵素は、日本住血吸虫 69 由来の N 末端グルタチオン S-トランスフェラーゼ タグを有する大腸菌で異種発現されました (材料と方法を参照)。 可溶性タンパク質の高レベルの生産に好ましい条件を調査するために、発現中のイソプロピル-β-D-1-チオガラクトピラノシド（IPTG）誘導時の温度を変化させました（37℃、28℃、および17.5℃）。 図 S6 は、プロ DlPPO1 とプレプロ DlPPO1 の両方の最も効率的な発現温度が 17.5 °C であったのに対し、37 °C では可溶型と非可溶型の両方の発現レベルが最低となったことを示しています。 低温発現下での可溶性 PPO 酵素の効果的な生産は、Juglans regia (20 °C)67、Agaricus bisporus (20 °C)3、Solanum lycopersicum (20 °C)17、Malusdomestica (20 °C) の TYR についても報告されています。 66、ストレプトマイセス・アベルミティリス（18℃）70、ストレプトミセス・エスピー。 ZL-24 (19 °C)68 および Larrea tridentata (25 °C)32。

真核生物の PPO の C 末端ドメインは、触媒ドメインのフォールディングに必要であることが報告されています 71。 これまでのところ、活性ブドウ PPO72 の発現は、C 末端ドメインを持たない植物 PPO の生産に成功した唯一の例です。

架橋アガロースに固定化されたグルタチオンの親和性を適用したアフィニティークロマトグラフィーによる精製により、発現培養物 1 リットルあたり、GST 融合プロ DlPPO1 および GST 融合プレプロ DlPPO1 がそれ​​ぞれ 35.3 および 60.0 mg 得られました (図 S7)。 。 ＨＲＶ３ＣプロテアーゼによるＧＳＴ融合タグの除去により、それぞれ５．７ｍｇおよび７．０ｍｇの潜在的なプロＤＩＰＰＯ１およびプレプロＤＩＰＰＯ１が得られた（表１）。 プレプロ-DlPPO1 は、総タンパク質活性の 13.5% の回収率と 7.09 ± 0.05 U mg-1 の比活性で精製に成功しました。一方、プロ DlPPO1 は、総タンパク質活性の 19.6% の回収率と 7.09 ± 0.05 U mg-1 の比活性で回収されました。 28.3 ± 0.04 U mg-1。 DlPPO1 変異体の銅含有量は、Cu(II) をアスコルビン酸塩で Cu(I) に還元し、その後 546 nm での Cu(I) と 2,2'-ビキノリンの錯体形成により測光的に測定されました73。 プロ-DlPPO1およびプレプロ-DlPPO1の銅含有量は、活性部位あたりそれぞれ1.3±0.018および2.0±0.030銅イオンであることが観察された。 新たに精製したタンパク質は、50 mM Tris-HCl および 250 mM NaCl (pH 7.5) で溶出し、すぐに 100 mM MES および 200 mM NaCl (pH 6.5) に交換し、両方の保存のために 30%(v/v) のグリセロールを適用しました。使用するまで -80 °C で生成します。 最終的なプロＤＩＰＰＯ１およびプレプロＤＩＰＰＯ１調製物の純度は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって確認された（全長ゲルについては図１および図Ｓ８）。

精製の異なる段階でのプロ-DlPPO1 (左) とプレプロ-DlPPO1 (右) の SDS-PAGE。 (A) 細菌細胞ペレットの不溶性画分、(B) 総可溶性タンパク質、C) グルタチオン アフィニティー クロマトグラフィー (ÄKTA FPLC での最初の精製ステップ) 後に溶出した GST 融合タンパク質である GST-DlPPO1、(D) 画分GST-DlPPO1 が HRV3C プロテアーゼによって切断された後のタンパク質、および E) 2 回目のグルタチオン アフィニティー クロマトグラフィーからの最終 DlPPO1 生成物 (赤枠でマーク、表 2 を参照)。 各ゲルの最初のレーンは分子量マーカーです。 全長ゲルを図 S8 に示します。

ゲル電気泳動により、最終的に精製されたプロ-DlPPO1 およびプレプロ-DlPPO1 の顕著なバンドがそれぞれ約 57 kDa および約 67 kDa で示されました。これは、ロンガン PPO1 の潜在型 (プロ-DlPPO1) および前駆体 (プレプ​​ロ-DlPPO1) の形態が示唆されています。得られた。 プロ DlPPO1 とプレプロ DlPPO1 の理論質量は、2 つの保存されたジスルフィド結合 (-4H または - 4.032 Da) と 1 つのチオエーテル橋の存在を考慮して、構成元素の原子量と同位体組成を使用して、それぞれのタンパク質の合計式から計算されました 74。表 2 に示すように (- 2H または - 2.016 Da)。酵素エレクトロスプレーイオン化の実際の分子量を確認するために、質量分析法 (ESI-MS) を適用しました。 pro-DlPPO1 は 56,845 Da を生成しました (図 2)。これは、ベクター由来の GlyProMet (図 S5 で - 3、- 2、- 1 としてマーク) から最後まで計算されたタンパク質の質量とよく一致しています。潜在的な PPO の配列 (Ala 1 → Asp 503)。 これは、プロ-DlPPO1 が 2 つのジスルフィド結合と 1 つのチオエーテル架橋を有する潜在的な PPO 形態として発現されたことを確認します。 さらに、プレプロ-DlPPO1 は 67,285 Da の質量を有し、1 つのチオエーテル橋と 2 つのジスルフィド結合も含むと測定されました (図 2)。 質量は、プレプロポリペプチド (Met 1 → Asp 599) に発現ベクターから生じる 3 つのアミノ酸 GlyProMet (-3、-2、-1) を加えた完全な配列と完全に一致します。

前駆体プレプロ-DlPPO1 および潜在的プロ-DlPPO1 の ESI-MS。 (A) プロ-DlPPO1 および (B) プレプロ-DlPPO1 の全体の質量スペクトルが示されていますが、挿入図は 2 つの最も顕著な荷電段階の拡大図を表しています。 酵素の 2 つの状態の計算および測定された質量を表 2 に示します。

サーマルシフトアッセイは、組換えタンパク質の熱安定性を評価するために使用されています8、17、75。 ここでは、精製したプロ-DlPPO1 タンパク質とプレプロ-DlPPO1 タンパク質の pH 6.5 (保存緩衝液条件) での熱安定性をテストしました。 図 3 に示すように、プレプロ DlPPO1 では 69.5 °C および 77.5 °C の 2 つの融解温度 (Tm) が測定されましたが、プロ DlPPO1 は 3 つの Tm 値 (54.5 °C、70.5 °C、および 81.5 °C) を示しました。酵素が完全に変性するまで。 プロ-DlPPO1のアンフォールディングは、プレプロ-DlPPO1(約65℃)よりもはるかに低い温度(約40℃)で始まりました(図3、図S9)。 得られたプロ-DlPPO1 の最初の Tm は、酵素の両方の変異体で観察された他の Tm 値よりもはるかに低くなります。 これは、潜在型プロ-DlPPO1 が、その前駆体であるプレプロ-DlPPO1 よりも著しく低い温度である程度の制限されたアンフォールディングを示すことを強く示しています。 プロ-DlPPO1 にはプレプロ-DlPPO1 にも存在するドメインのみが含まれるため、シグナルペプチドを含めることで実際に DlPPO1 の全体的な熱安定性が向上し、シグナルペプチドがタンパク質の安定性の維持に役立つと考えられます。

サーマルシフトアッセイによる DlPPO1 変異体の熱安定性。 融解温度値 (Tm) は、温度増加に対する蛍光強度 (I、任意の単位)​​ の導関数から決定されました。 プレプロ-DlPPO1 (青線) の Tm 値は 69.5 ℃ および 77.5 ℃ となりました。 pro-DlPPO1 の Tm 値は 54.5 ℃、70.5 ℃、および 81.5 ℃となりました。 生の蛍光強度を図 S9 に示します。

pro-DlPPO1 の活性化をチラミンの変換によってモニタリングし (図 S3)、酵素の潜伏期間を克服するための適切な SDS 濃度を検証しました。 反応は、様々なSDS濃度(0～1.5mM)を含むpH7.0の50mM MES中で、0.5μgのプロDlPPO1および基質として8mMチラミンを使用して調べた。 図S10に示すように、SDS濃度が0.00 mMから0.25 mMに増加すると、プロDlPPO1活性が大幅に向上し、0.25 mM SDS（28.3 ± 0.04 U mg-1）で最高の活性化効率が達成されました。 SDS 濃度が高くなると、酵素活性は徐々に低下しました。 最適値の半分の活性の損失は、1.25 mM の SDS 濃度で観察されました。 したがって、プロＤＩＰＰＯ１の活性化に最適なＳＤＳ濃度は０．２５ｍＭと定義され、このレベルの添加された活性化剤がその後のすべての実験に適用された。 質的に同一の活性化挙動がプレプロ-DlPPO1 で見られました (図 S10)。

ほとんどの酵素は SDS 処理下で生物活性を失いますが、PPO はある程度 SDS に耐性がありますが、これはおそらく構造内にジスルフィド結合が存在することが部分的に原因です 55、76、77。 SDS は、活性部位の露出を可能にし、基質へのアクセスを促進する潜在型の N 末端および C 末端の構造変化を導入することによって PPO の活性化を開始します 78。 PPO の活性化は一般に低 SDS 濃度で達成されますが、高濃度のアニオン性界面活性剤は酵素活性を著しく阻害します 79,80。これは、DlPPO1 で観察される SDS 活性化プロファイルと一致します。 潜在型 PPO の活性化に SDS を使用することは、植物 PPO の潜伏期間をほぼ完全に排除し、成熟 PPO (C 末端ドメインの除去後) によく似た活性を提供するため、in vitro での最良の活性化方法であると報告されています。 66. SDS 活性化の程度は植物抽出物によって大きく異なります 78。 たとえば、潜在性ジャガイモ PPO (Solanum tuberosum)33 を活性化するには 0.13 mM SDS、キノコ PPO (Agaricus bisporus)81 には 0.35 mM SDS、テーブルビート PPO (Beta vulgaris)82 には 0.69 mM SDS、モモ PPO には 2 mM SDS が必要でした。 (Prunus persica cv. Paraguaya)83 およびマンゴー PPO (Mangifera indica) の 6.93 mM SDS 84。 タンポポ PPO の活性化に必要な界面活性剤の濃度は、主に触媒ドメインと C 末端ドメインの間の界面を形成するアミノ酸によって決定されることが示されています 85。 pro-DlPPO1 活性化のための 0.25 mM SDS の使用は、クルミ JrPPO1 (2 mM SDS)67、トマト SlPPO1 および SlPPO2 (1.5 mM SDS)17、キノコ AbPPO4 (2) などの他の異種発現 PPO と比較した場合、下限にあります。 mM SDS)3、リンゴの場合は MdPPO1 (3 mM)、MdPPO2 (2 mM)、および MdPPO3 (4 mM)66。

pH は、PPO の活性に影響を与えるパラメータの 1 つです86。 プロ DlPPO1 活性について反応緩衝液の pH を最適化するために、0.5 μg のプロ DlPPO1、基質として 8 mM チラミン、および 0.25 mM SDS を使用して、pH 5.5 ～ 8.5 の範囲の 50 mM MES および TRIS 緩衝液を通して酵素反応を調べました。酵素の活性化に。 図 S11 は、酵素がこの pH 範囲で異なる程度の活性を示すことを示しています。 最高の活性は、MES緩衝液中のpH 7.0（28.3±0.04U mg-1）で示されましたが、活性はpH 6.5で17％わずかに減少し、pH 6.0および5.5ではそれぞれ61％および86％大幅に減少しました。 同様に、より高い pH (pH 7.5 ～ 8.5) では活性が大幅に低下しました。 pH 7.5 では 43%、pH 8.0 では 74% の減少が観察されました。 活性は、pH 8.5 ではほぼ枯渇し、最適値から 96% の活性損失が見られました。 リンゴ (MdPPO1 および MdPPO3)66 およびキノコ (AbPPO4)3 のチロシナーゼについては、最適 pH 7.0 が以前に報告されています。 MdPPO366 では、7.5 というわずかに高い最適 pH が観察されました。 クルミ由来の JrPPO1 および JrPPO2 は最適 pH 6.067 より低く、一方、Streptomyces sp. 由来の細菌チロシナーゼは pH 6.067 でした。 泥炭地 (SzTYR) からの微生物は、自然の pH 環境への適応の結果として、pH 9.0 という異常に高い最適 pH を明らかにしました 68。

まず、プロ DlPPO1 の触媒性能を 4 つの標準基質を使用して調べました (図 S3)。2 つのモノフェノール (チラミン、d-チロシン、l-チロシン) と 2 つのジフェノール (ドーパミン、l-DOPA) を酵素の至適 pH 7.0 で適用しました。 ＳＤＳ濃度は０．２５ｍＭであった。 pro-DlPPO1 は、モノフェノールおよびジフェノールのカテゴリーからの 4 つの標準基質すべてを受け入れるため、TYR (EC 1.14.18.1) として分類できます。 KM 値と kcat 値は非線形回帰によって計算され、基質特異性は kcat/KM 比を使用して推定されました。 pro-DlPPO1 の基質特異性について報告されたデータを表 3 および図 S13 に示します。 ジフェノール基質ドーパミンは l-DOPA (kcat: 98 ± 8.5 s-1) よりも速く処理され (kcat: 260 ± 22 s-1)、モノフェノールのチラミン (kcat: 35 ± 1.9 s-1) は l-DOPA よりも速く水酸化されます。 l-またはd-チロシン。 さらに、プロ-DlPPO1 はドーパミンの KM 値が低く (KM: 2.0 ± 0.35 mM)、その結果、試験した 4 つの標準基質の中で最も高い触媒効率 (kcat/KM) が得られます。 ドーパミンの kcat/KM 比は、l-DOPA (28 ± 3.9 s-1 mM-1)、チラミン (8.2 ± 0.91 s-1 mM-1) よりも 4.6、16、336、および 504 倍高くなります。 ）、d-チロシン（0.39 ± 0.016 s-1 mM-1）、l-チロシン（0.26 ± 0.016 s-1 mM-1）（表 3）。 プレプロ-DlPPO1 は、標準的なモノフェノール (チラミンとチロシン) とジフェノール (ドーパミンと l-DOPA) の両方も受け入れますが、触媒効率の程度は異なります (表 3 および図 S14)。 プレプロ-DlPPO1 は、プロ型で観察された KM 値 (KM: 2.0 ± 0.35 mM) と同様の KM 値 (KM: 2.3 ± 0.27 mM) でドーパミンに結合します。 しかし、プレプロ-DlPPO1の触媒効率はプロ-DlPPO1と比較して7.5倍低下し、kcat/KMは17±2.4s-1mM-1である。 プレプロ DlPPO1 によるジフェノール I-DOPA の変換（kcat/KM 12 ± 1.1 s-1 mM-1）は、触媒活性が低いため（kcat: 40 ± 2.1 s-1）、プレプロ DlPPO1 と比較して 2.4 倍遅かった。プロDlPPO1。 同様の観察がモノフェノール基質についても認められた：プレプロ-DlPPO1 によるチラミンの水酸化（kcat/KM 1.6 ± 0.14 s-1 mM-1）は、プロ-DlPPO1 の場合よりも効率が 5.2 倍低く、同時に KM が増加する。 15 ± 1.0 mM に低下し、触媒活性が低下します (kcat: 24 ± 1.4 s-1)。 モノフェノール類の l-チロシンおよび d-チロシンに対する動態検査では、kcat/KM 比の減少が実証され、これはプロ DlPPO で観察された値よりも 1.3 倍および 1.6 倍低いです。

自然環境における DlPPO1 の動態挙動についての洞察を得るには、一連の天然フェノール基質 ((-)-エピカテキン、4-メチルカテコール、カフェ酸、ピロガロール、没食子酸、ケルセチン、バニリン酸、フェルラ酸) を使用します (図 S2)。 ）、これらはすべてリュウガンの皮、果肉、種子から検出されており39、40、41、評価されました。 pro-DlPPO1 の天然の基質特異性を報告するデータを表 3 および図 S15 に示します。 動態研究を通じて、プロ-DlPPO1 はポリフェノール (-)-エピカテキン、4-メチルカテコール、カフェ酸、ピロガロールに対して活性であるのに対し、この酵素は試験した残りの基質に対しては完全に不活性であることが明らかになりました。 プロ-DlPPO1 の最も高い効率は、(-)-エピカテキンに対して観察され (kcat: 270 ± 15 s-1)、KM は 0.35 ± 0.052 mM で、kcat/KM は 800 ± 120 s-1 mM-1 となりました。 この証拠は、(-)-エピカテキンがリュウガンの DlPPO1 の生理学的基質の 1 つである可能性が高いことを示唆しています。 4-メチルカテコール、ピロガロール、およびカフェ酸の変換率は、(-)-エピカテキンよりも低く、kcat/KM 値は 590 ± 99 s-1 mM-1、70 ± 9.7 s-1 mM-1、および 4.3 ± でした。それぞれ0.72 s-1 mM-1。 しかし、これらの天然基質に対する触媒効率は、プレプロ-DlPPO1 では大幅に減少しました。 (-)-エピカテキンを用いた動態検査では、より高い KM 値 (1.1 ± 0.12 mM) が得られ、前駆体のこの基質に対する特異性が pro-DlPPO1 (KM = 0.35 ± 0.052 mM) よりも低いことが示されました。 したがって、プレプロ-DlPPO1の触媒効率はわずか33±4.1s-1 mM-1であることが観察され、これはプロ-DlPPO1の値よりも23倍低い。 同様に、４－メチルカテコール、カフェ酸およびピロガロールに対するプレプロ－Ｄ１ＰＰＯ１の特異性は、プロ－Ｄ１ＰＰＯ１と比較してより高いＫＭ値によって示されるように、プロ－Ｄ１ＰＰＯ１よりも低い。 プレプロ-DlPPO1 の天然の基質特異性を報告するデータを表 3 および図 S16 に示します。 得られた kcat/KM 値 17 ± 1.7 s-1 mM-1 (4-メチルカテコール)、2.5 ± 0.20 s-1 mM-1 (カフェ酸)、および 15 ± 1.2 s-1 mM-1 (ピロガロール) は、次のことを示しています。プレプロ-DlPPO1の触媒効率は、プロ-DlPPO1に比べてそれぞれ36倍、1.7倍、および4.7倍減少した。 したがって、シグナルペプチド成分は、フェノール化合物の酸化および水酸化を触媒する際の PPO の速度低下の原因の 1 つである可能性があります。

(-)-エピカテキンの濃度が 2 mM を超えると、酵素変換は、プレプロ DlPPO1 およびプロ DlPPO1 の両方について、より低い基質レベルで見られる速度よりも遅くなりました (図 S15A および S16A)。 Michaelis-Menten モデルに基質自体による競合阻害 (「基質阻害」、式 S3) を含めることで、モデル化された濃度範囲をプロ DlPPO1 については最大 3 mM、プレプロ DlPPO1 については最大 5 mM まで拡大することができました。 酵素変換の数学的モデルを変更すると、得られる反応速度パラメーターに大きな変化が生じます。 プロ DlPPO1 (KM = 4.6 ± 2.0 mM、kcat = 1500 ± 590 s−1、Ki = 0.56 ± 0.26 mM) および prepro-DlPPO1 (KM = 6.1 ± 3.7 mM、kcat = 140 ± 72 s−1) の場合1、Ki = 1.2 ± 0.79 mM) KM と kcat の両方が大幅に増加しており (表 3 と比較)、基質自体 (Ki) の新たに導入された阻害効果を補いますが、すべてのフィッティングパラメーターの分散は単純なパラメータに比べて大幅に膨張しています。ミカエリス・メンテンモデル。 プロ DlPPO1 およびドーパミンの場合 (図 S13C; KM = 1.2 ± 0.11 mM、kcat = 250 ± 15 s-1、Ki = 30 ± 7.3 mM)、はるかに高い Ki は基質阻害の効率が低いことを示し、パラメーターのインフレ分散はそれほど深刻ではなく、kcat と Km の両方が単純な Michaelis-Menten モデルよりもわずかに低くなります。

PPO の二核銅中心はエナンチオ選択的に機能することが報告されています 32。 チロシンに対するプロ-DlPPO1の触媒反応のエナンチオ選択性を調べた。 この酵素は、l-エナンチオマー(0.26 ± 0.016 s-1 mM-1)よりもわずかに高い触媒効率0.39 ± 0.016 s-1 mM-1でd-チロシンに対する優先性を示しました。 1 mM の d-チロシンは 0.11 ± 0.01 U mg-1 の速度で変換され、これはプロ DlPPO1 による l-チロシン変換の速度より 1.1 倍速いです。 基質キラリティーの効果はキノコ AbPPO4 でも観察され、l-チロシンの方が d-対応物よりわずかに好ましかった3。 Streptomyces sp.によって産生されるチロシナーゼ。 REN-21 は、d-チロシンよりも l-チロシンに対して 35.9 倍速く反応しました。これは、報告されている PPO の中で基質チロシンに対する最も強いエナンチオ選択性効果です 87。 d-立体異性体基質に対する優先性はナス (Solanum melongena) から精製された PPO でも報告されており、0.1 mM d-DOPA の変換は l-DOPA88 より 1.8 倍速かった。 植物 PPO におけるエナンチオ特異的反応の別の例は、Larrea tridendata 由来のラレアトリシン ヒドロキシラーゼ (LtPPO) に見られます。これは、(-)-エナンチオマーと比較して (+)-ラレアトリシンに対して顕著な優先性 (23 倍) を示します。研究 AbPPO4 は、(-)-ラレアトリシン (13 倍) を優先することによって逆の効果を明らかにしました 32。

プレプロ-DlPPO1 およびプロ-DlPPO1 を、酸素の存在下での酵素のオキシ状態の形成を評価するために、H2O2 を使用して分光光度法で検査しました。 プレプロ DlPPO1 に H2O2 を添加すると、比吸収バンド (~345 nm) が増加します。これは、III 型銅中心酵素の酸素誘起オキシ型特性を示しており、電荷移動に起因すると考えられています。 \({\text{O}}_{2}^{2 - } \left( {\pi_{\sigma }^{*} } \right) \から {\text{Cu}}\left( {II} \right)_{{d_{{x^{2} - y^{2} }} }}\)89。 同様の観察がプロ-DlPPO1でも行われ、オキシ付加体の形成により345 nmで顕著な吸収バンドが形成されました（図4）。 滴定がそれぞれ、プレプロ-DlPPO1 については約 150 当量の H2O2、プロ-DlPPO1 については約 175 当量の H2O2 に達したときに、345 nm での吸収は飽和しました。 得られた吸収係数は、プレプロ-DlPPO1 については酵素 1 モルあたり約 9000 M-1 cm-1、プロ-DlPPO1 については酵素 1 モルあたり約 10,300 M-1 cm-1 です。 H2O2 によるオキシ型の形成は、天然源から抽出された PPO について以前に示されています 60,90,91。 レモンバーム (Melissa officinalis)86、サツマイモ (Ipomoea butatas)87、およびクルミの葉 (Juglans regia)52 から精製されたカテコール オキシダーゼは、2 当量の H2O2 を添加するとオキシ型が完全に飽和しました。 ミズゴケ (Lycopus europaeus) カテコールオキシダーゼでは、λ345 バンドを飽和させるために 6 当量の H2O2 が必要でしたが、クロポプラ (Populus nigra)89 では 80 当量の H2O2 が必要でした。 Solanum lycopersicum から異種発現された SlPPO1 および SlPPO2 17 は、それぞれ 25 および 11 当量の H2O2 添加で完全に飽和したオキシ型を生成することが報告されました。 さらに、H2O2 の添加により、大腸菌で異種発現された Coreopsis grandiflora 由来の野生型 CgAUS が誘導され、24 当量の H2O292,93 で酸素付加体が完全に形成されました。 本研究は、シグナルペプチドが結合したまま異種発現されたプレプロ-PPO のオキシ型形成を調査した最初の研究です。

H2O2で処理した後のプロ-DlPPO1およびプレプロ-DlPPO1のUV/Visスペクトル。 (A) H2O2 で処理した後の pro-DlPPO1 の全体スペクトル。 挿入図は、345 nm での吸収と H2O2 の添加当量の関係を示しています。 (B) H2O2 で処理した後のプレプロ DlPPO1 の全体スペクトル。 挿入図は、345 nm での吸収と H2O2 の当量を示しています。 (C) H2O2 で処理した後のプロ DlPPO1 の 300 ～ 400 nm でのスペクトルの拡大図。 (D) H2O2 で処理した後のプレプロ DlPPO1 の 300 ～ 400 nm でのスペクトルの拡大図。

プロ DlPPO1 の酵素と基質の相互作用についてのさらなる洞察を提供するために、分子ドッキング研究が行われました。 シミュレーション研究は AutoDock Vina ソフトウェア 94 を使用して実行されました。 プロ DlPPO1 の構造モデルは、「材料と方法」に記載されているように調製され、コンピューター計算に使用されました。 結合ポーズは、調査したすべての基質について計算され（図S17およびS18）、Zn置換活性部位（PDB：4P6R）に結合した基質l-チロシンを含むBacillus megateriumのTYR構造に従って検証されました。 その結果、調査した基質の推定位置と活性中心周囲のこれらの位置の結合エネルギーに関する詳細な情報が得られました（表S3）。 天然基質 (-)-エピカテキンは、測定された最低の KM (KM = 0.35 ± 0.052 mM) と最も好ましい結合エネルギーによって強く示唆されるように、調査した基質の中で最も強い結合親和性を示しました (表 S3)。 4-メチルカテコールとカフェ酸の同様の KM 値と組み合わせたより高い触媒効率は、4-メチルカテコールがカフェ酸よりも DlPPO1 とより安定な複合体を形成することを示しています。 ピロガロールは、試験した天然基質の中で最も高い KM を特徴とし、プロ DlPPO1 と基質間の弱い結合相互作用を示唆しています。 カフェ酸で観察された触媒効率よりも高い触媒効率は、ピロガロールの kcat 値がはるかに高いためです (表 3)。

DlPPO1 の活性中心にドッキングした (-)-エピカテキンを LiqPlot + でさらに分析したところ、基質と二銅活性中心周囲のアミノ酸との特異的相互作用が明らかになりました。 具体的には、(-)-エピカテキンの o-ジフェノール環上の 2 つのヒドロキシ基の 1 つ (図 5) が 2 つの水素結合を確立します。 1 つは保存された銅配位 His243 (2.8 Å) のイミダゾール窒素を持ち、もう 1 つは Met257 (2.8 Å) のカルボキシル主鎖グループを持ちます。 同じ環の 2 番目のヒドロキシ基は 2 つの銅イオンと相互作用し、酸化反応に適した位置にあります (それぞれ、CuA: 4.1 Å および CuB: 3.7 Å)。 さらに、残基 His87、Asn109、Ala231、Glu235、Asn236、Gly258、Asn259、Phe260、および Ala263 との 9 つの疎水性相互作用が基質全体をカバーしています (図 5)。 他の植物 PPO と同様に、ゲートキーパー残基である保存された Phe26017 は、(-)-エピカテキンのフェノール環に変化し、サンドイッチ型の π-π 相互作用を形成します。 (-)-エピカテキンの高親和性結合は、植物 PPO がフェノール系二次代謝物を好むことを示しており、(-)-エピカテキンが DlPPO1 の生理学的基質であることを強く示唆しています。 同様の結果が、ジヒドロカルコンフロレチンに対して高い親和性を有するトマト PPO (SlPPO1) 17 と、ブテインがその天然基質として提案されている Coreopsis grandiflora 由来のオーロンシンターゼについても示されています 51,95。

(-)-エピカテキンの DlPPO1 へのドッキング。 (A) DlPPO1 の活性中心における (-)-エピカテキンの結合姿勢。 (B) DlPPO1 と (-)-エピカテキンの相互作用プロット。 カラーコード: マゼンタのテキストは水素結合を形成する残基を表し、オリーブのテキストは疎水性相互作用を示す残基を示します。 (-)-エピカテキンおよび水素結合を形成する 2 つのアミノ酸では、炭素原子は黒の黒丸で示され、酸素原子は赤で描かれ、窒素原子は青で示され、相互作用プロットには単一の硫黄原子が存在します。オレンジ色で強調表示されます。

この研究では、D. ロンガン由来のプレプロ DlPPO1 を発現、精製し、プロ DlPPO1 と比較して特徴付けました。 これは、N末端シグナル配列がある場合とない場合の両方で、原核生物系で発現されるPPOの生化学的差異に関する最初の報告となる。 UV-Vis 分光法でモニタリングした H2O2 による滴定により、DlPPO1 にタイプ III の銅中心が含まれていることを確認しました。 約 150 および約 175 当量の H2O2 を添加した後、オキシ型がそれぞれプレプロ DlPPO1 およびプロ DlPPO1 で完全に発達したことを示す 345 nm 付近の吸収バンドが現れました (図 4)。 速度論的実験により、両方の酵素がモノフェノール基質を受け入れることが示されたため、DlPPO1 の両方の形態はチロシナーゼ (EC. 1.14.18.1) として分類されました。 プロＤＩＰＰＯ１は、試験したすべての基質に対して、プレプロＤＩＰＰＯ１よりも低いＫＭ値およびより高いｋｃａｔ値を示し、その結果、はるかに高い反応速度効率を示した（表３）。 N末端シグナルペプチドは、DlPPO1の活性部位への基質結合に対する効率的な障壁を提供すると思われる。 折り畳まれていないと思われるシグナルペプチドを含めることにより、プロ-DlPPO1の熱安定性をも超えるプレプロ-DlPPO1の実質的な熱耐性がもたらされた(図3)。 DlPPO1 の触媒機能に対するシグナルペプチドの阻害効果と組み合わせて、シグナルペプチドが DlPPO1 に与える熱安定性の向上は、現在考えられているように、これらのペプチドのより秩序立ったコンパクトな構造を示している可能性があります。 (-)-エピカテキンは、最低の KM、最高の触媒効率 (表 3)、DlPPO1 への最も好ましい結合 (表 S3 および図 5)、さらに調査したすべての基質の中で最も重度の基質阻害を示しました。 この結果は、(-)-エピカテキンが DlPPO1 の生理学的基質であることを示唆しています。 この研究は、費用のかかる果実の褐変反応を効果的に管理するための将来の収穫後の介入に役立つ、リュウガン PPO の生化学的および触媒的特性についての洞察を提供します。

別段の指定がない限り、使用した化学薬品はすべて Sigma-Aldrich (オーストリア、ウィーン) または Carl-Roth (ドイツ、カールスルーエ) から購入したもので、少なくとも分析グレードのものでした。 核酸操作用の酵素は、New England Biolabs (NEB; フランクフルト・アム・マイン、ドイツ) または Thermo Fisher Scientific (ウォルサム、マサチューセッツ州、米国) から入手しました。

リュウガンの葉は、タイ北部に位置するランプーン（北緯 18.481174 度、東経 99.176014 度）で収集され、直ちに研究室に輸送され、-80 °C で保存されました。 研究目的でリュウガンの葉を収集する許可は地元の所有者から得られました。 健康な葉を液体窒素下で粉砕し、Gambino et al.96 に従って、2%(m/v) 臭化セチルトリメチルアンモニウム、2.5%(m/v) ポリビニルピロリドンを含む抽出バッファーを使用した Rapid CTAB 法を使用して全 RNA を単離しました。 M NaCl、100 mM トリス-HCl (pH 8.0)、25 mM エチレンジアミン四酢酸 (EDTA、NaOH で pH 8.0 に設定)、および 2%(v/v) β-メルカプトエタノール。 続いて、ポリ-Tプライマー(5'-T25VN-3')およびモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素を使用してcDNAを合成した。 リュウガン PPO (プレプ​​ロ DlPPO1 およびプロ DlPPO1) 遺伝子の特異的プライマーを設計しました (表 S2)。 プライマーは、Q5 High-Fidelity DNA ポリメラーゼ (NEB) を使用して cDNA テンプレートから PPO 遺伝子を増幅するために使用されました。 以下の手順により、PCR 産物を pGEX-6P-SG69 発現ベクターにクローニングしました。pGEX-6P-SG ベクター (1 fmol) を、5 fmol の精製プレプロ DlPPO1 または 5 fmol のプロ DlPPO1 アンプリコンとインキュベートしました。 mM アデノシン三リン酸 (ATP)、4 単位の Esp3I (Thermo Fisher Scientific)、および 160 単位の T4 DNA リガーゼ (NEB) を総量 6 μL の 1 × CutSmart バッファー (NEB) に加え、30 °C で 90 分間、その後65℃、20分間の酵素不活化により。 得られたプラスミドを化学的にコンピテントなSHuffle T7 Express細胞(NEB)に形質転換した。 形質転換体を、100 mg L-1 アンピシリンを補充したLB寒天プレート上で37℃で一晩インキュベートすることにより選択した。 陽性クローンはコロニー PCR で検出され、Microsynth GmbH (ウィーン、オーストリア) が実施したサンガー配列決定を使用して検証されました。

組換えプラスミドでは、プレプロ-DlPPO1 遺伝子とプロ-DlPPO1 遺伝子が pGEX-6P-SG ベクターの GST タグと N 末端で融合されています。 ヒトライノウイルス 3C プロテアーゼ (HRV3C) 認識配列 (LEVLFQ|GP) は GST タグと標的遺伝子の間に位置しており、精製時に目的のタンパク質からタグを制御してタンパク質分解的に分離できます。 2 つの融合遺伝子 (GST-prepro-DlPPO1 および GST-pro-DlPPO1) は、pGEX-6P-SG ベクターの合成 tac プロモーターを使用して効率的に過剰発現されました。 SHuffle T7 Express E. coli 株は、改変 2xYT 培地 (1.6%(m/v) トリプトン-ペプトン、1%(m/v) 酵母エキス、1%(m/v) NaCl、0.5%(m/v) で増殖させました。 ／ｖ）アンピシリン（１００ｍｇ／Ｌ）の存在下、ＮＨ４Ｃｌ、０．５％（ｖ／ｖ）グリセロール、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＣａＣｌ２；ｐＨ７．５に設定）。 一晩培養物を 37 °C で増殖させました。 発現バッチに飽和一晩培養物を接種し、OD600 が 0.6 ～ 0.8 の値に達するまで同じ温度で約 4 時間増殖させました (OD600 が 0.05 から開始)。 タンパク質の量を最適化し、同時に封入体の形成を避けるために、発現のために温度を 17.5 °C に下げました。 培養物を0.5 mM IPTGで誘導し、2.0 mM CuSO4を添加した。 発現培養物を振盪下、17.5℃で48時間維持した。 OD600 が 7 ～ 10 の値に達したら、6500 × g、4 °C で 25 分間遠心分離して培養物を収集しました。

細胞溶解は、液体窒素を使用した凍結融解技術を実行して実行されました。 ペレットを溶解緩衝液（50 mM Tris-HCl pH 7.5、200 mM NaCl、1 mM EDTAおよび50 mM スクロース）に再懸濁しました。 リゾチーム (0.5 g/L) およびプロテアーゼ阻害剤 (1 mM フェニルメチルスルホニルフルオリドおよび 1 mM ベンズアミジン) をそれぞれ細菌細胞壁を溶解し、内在性プロテアーゼによるタンパク質分解を防ぐために添加しました。 懸濁液を振盪し、氷上で45分間インキュベートした。 次に、混合物を液体窒素中での凍結と、25 °C の水浴中での解凍を交互に 5 サイクル繰り返しました。 5 回目の凍結融解手順の後、2 mM MgCl2 と 0.02 g/L DNaseI を添加して、細菌細胞から放出された DNA によって引き起こされる溶液の粘度を除去し、タンパク質の抽出を改善しました。 続いて、溶解物を 7500 × g、4 °C で 1 時間遠心分離しました。

クロマトグラフィー精製は、4 °C の冷蔵庫に置いた ÄKTA Purifier (GE Healthcare) を使用して実行しました。 ろ過したライセートを 50 mL インジェクションループに入れ、50 mM Tris-HCl、250 mM NaCl pH 7.5 の溶液を結合バッファーとして使用して、プレパックされた 5 mL GSTrap FF カラムにアプライしました。 標的 GST 融合タンパク質はカラム上にトラップされましたが、結合していないタンパク質は 1 mL/min の流速で適用された結合バッファーとシャペロン洗浄バッファー (50 mM Tris-HCl、250 mM NaCl、10 mM MgCl2) によって洗い流されました。標的融合タンパク質から結合シャペロンを除去するために、pH 8 に設定した 5 mM Na-ATP (15 カラム容量に適用) を適用しました。 最終的に、pH 7.5 に設定した 50 mM Tris-HCl、250 mM NaCl、および 15 mM 還元グルタチオンで目的のタンパク質を溶出しました。 ＧＳＴ融合タンパク質画分をプールし、分子量カットオフ３０ｋＤａのＶｉｖａｓｐｉｎ超遠心分離装置（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して濃縮した。 グルタチオンを除去するために、バッファーを 50 mM Tris-HCl pH 7.5 および 250 mM NaCl に交換しました。 続いて、サンプルを自社で調製した GST-HRV3C プロテアーゼと質量比 1:50（プロテアーゼ：GST 融合タンパク質）で混合しました。 タンパク質分解は 4 °C で 48 時間かけて実行されました。 その後、切断されたタンパク質を再度 5 mL GSTrap FF カラムにアプライしました。 このとき、GST タンパク質と GST タグ付きプロテアーゼはカラムに捕捉されましたが、PPO はカラムを通って流れることができ、すぐに溶出しました。 プレプロ-DlPPO1 およびプロ-DlPPO1 のタンパク質画分を収集し、濃縮し、30%(v/v) グリセロールを含む 100 mM MES および 200 mM NaCl pH 6.5 中で -80 °C で保存しました。 タンパク質濃度は、280 nm での吸収と ExPASy ProtParam98 によって提供される吸光係数に基づいたランバート ベールの法則 97 を使用して決定されました。 発現タンパク質の予測分子量は、構成元素の原子量と標準同位体組成から推定されました 74。 プレプロ-DlPPO1 およびプロ-DlPPO1 酵素の銅含有量は、酢酸で酸性化し、アスコルビン酸塩で Cu(II) を Cu(I) に還元した後、測光的に評価されました。これにより、2,2 ' による Cu(I) のキレート化が可能になりました。 -Hanna et al.73 によって公開された方法によるビキノリン。

プレプロ DlPPO1 およびプロ DlPPO1 の質量測定は、質量範囲 200 ～ 4000 m/z および外部質量 3 ppm に近い質量精度を備えた ESI-LTQ-Orbitrap Velos (Thermo Fisher Scientific Bremen、ドイツ) 質量分析計によって実行されました。較正。 MS の前に、100 μg のタンパク質溶液を 5 mM 酢酸ナトリウム (pH 7.0) 緩衝液に交換しました。 タンパク質溶液は、質量分析計に適用する直前に、80%(v/v) アセトニトリルと 0.1%(v/v) ギ酸の混合物で 100 倍に希釈しました。

変性ＳＤＳ－ＰＡＧＥは、Ｌａｅｍｍｌｉら９９によって記載されているように、ミニゲル装置（Ｍｉｎｉ－ＰＲＯＴＥＡＮ Ｔｅｔｒａ Ｃｅｌｌ、Ｂｉｏ－Ｒａｄ）で実施した。 プレプロ-DlPPO1 およびプロ-DlPPO1 を、30 g/L SDS、6% (v/v) グリセロール、75 mM トリス、2.5%(v/v) 2-メルカプトエタノールおよび 50 mg/L を含むゲルローディングバッファーで希釈しました。ブロモフェノールブルーをpH 6.8に設定。 変性を促進するために、サンプルを 99 °C (ThermomixerComfort、Eppendorf) で 5 分間加熱しました。 次にサンプルを分子量標準 (Precision Plus Protein Standard Dual Color、Bio-Rad) とともに 5% スタッキングおよび 11% 分解能のポリアクリルアミドゲルに適用して、タンパク質のサイズと純度に関する情報を提供しました。 電気泳動は 120 V で実行しました。ゲルは色素溶液 (200 mg/L クーマシー ブリリアント ブルー G-250、50 g/L Al2(SO4)3.16 H2O、10%(v/v) エタノールおよび 20 g/L) で染色されました。 H3PO4) で染色し、その後 10%(v/v) エタノールと 20 g/L オルトリン酸で脱染しました。 ゲルの写真は、BioRad Gel Doc XR Imaging System を使用して撮影されました。

酵素の 2 つの状態の安定性を決定するために、保存緩衝液 (50 mM MES pH 6.5 および 200 mM NaCl) 中の 2 つのアイソザイムの融点を測定するためにサーマルシフトアッセイを実施しました。 アッセイは、リアルタイム PCR 装置 (mastercycler ep-realplex、Eppendorf) で PCR チューブ (Axygen、INC Corning) を使用して 3 回実施しました。 反応溶液には、保存バッファー中に 10 μM の酵素と 4 × SYPRO Orange (Sigma-Aldrich) が含まれていました。 サンプルは、PCR 装置内で 4 °C から 94 °C まで 1 分あたり 1 K ずつ増加しながら徐々に加熱され、蛍光強度の変化は 470 nm で励起した後 560 nm で監視されました。 次に、各酵素を含む溶液の結果として得られた蛍光強度を、安定性分析のために温度に対してプロットしました。

DlPPO1活性は、酵素によるチラミンの変換時の480nmでの吸光度の増加をモニタリングすることにより、分光光度的に測定した。 標準測定は、プレプロ-DlPPO1 またはプロ-DlPPO を活性化するために決定された最適 SDS 濃度 (0.25 mM) で、総反応量 200 μL 中の酵素 0.5 μg およびチラミン 8 mM を使用して実行されました。 SDS が存在しない場合、テストした基材について利用可能な吸収時間曲線は得られませんでした (図 S12)。 吸収曲線とスペクトルは、TECAN infinite M200 (Tecan) を適用した 96 ウェルマイクロプレート内で 25 °C で記録されました。 活性は、実験曲線の最初の直線部分の傾き (吸光度対時間) から決定され、U/分として表されました。 酵素活性の 1 単位 (U) は、1 分あたり 1 μmol のキノンの生成を触媒する酵素の量として定義されました (1 U = 1 μmol/分)。 すべてのアッセイは 3 回繰り返して実行されました。 プロＤＩＰＰＯ１活性に対する反応緩衝液のＳＤＳ濃度およびｐＨの最適化は以下の通りである（下記を参照）。

測定 (200 μL) は、50 mM MES 中の 0.5 μg pro-DlPPO1 および 8 mM チラミンを使用して、さまざまな SDS 濃度 (0.00、0.05、0.10、0.25、0.50、0.75、1.00、1.25 および 1.50 mM) の存在下で実行されました。 pH7.0。 最適な SDS 濃度は、その後の他のすべての研究で使用されました。

pH 5.5 ～ 8.5 の一連の MES および Tris バッファーを反応バッファーとして使用し、さらなる反応速度論の研究に最適な酵素活性を提供する最も好ましい pH を決定しました。 各反応 (200 μL) は、0.5 μg pro-DlPPO1、8 mM チラミン、および前の実験から得られた最適な SDS 濃度を使用して、50 mM 緩衝液濃度で実行されました。

プレプロ-DlPPO1 およびプロ-DlPPO1 の基質特異性を、さまざまなフェノール基質を使用して調べました。 続いて、適切な活性をもたらした基質を選択して、速度論的パラメータを決定した。 活性は、2 つの標準モノフェノール基質 (チラミン、l-チロシンおよび d-チロシン)、2 つの標準ジフェノール化合物 (ドーパミンおよび l-DOPA)、および 4 つの天然フェノール基質 ((-)-エピカテキン、4-メチルカテコール、ピロガロールおよびカフェイン) について分光測光法で評価されました。酸）。 着色生成物の吸収曲線を、それぞれの基質の異なるモル濃度について TECAN Infinite M200 で監視しました。 反応混合物 (総量 200 μL) には、可変量の酵素 (表 S4 を参照、pH 6.5 の 100 mM MES および 200 mM NaCl に保存) および 50 mM MES 緩衝液 (pH 7) の反応溶液中の 0.25 mM SDS が含まれていました。形成された発色団のモル吸光係数 (ɛλmax) を表 S4 と図 S19 に報告します。 速度論的実験を行うために、基質の溶解度が制限されている場合には、予備的な KM 値付近の約 7 ～ 8 の基質濃度が選択されました (図 S13 ～ S16)。 KM と vmax の値は、ミカエリス・メンテン方程式 (式 S1) のヘインズ・ウルフ線形化 101 を適用することで得られたモデル パラメーターの初期値が指定されたレーベンバーグ・マルカート アルゴリズム 100 を使用した非線形回帰によって計算されました。 最大代謝回転速度 (kcat、式 S2) は、1 分あたりに変換された基質分子の総数を反応容積中に存在する酵素分子の総数で割ることによって評価されました。 基質阻害を示す酵素と基質の組み合わせについては、ミカエリス・メンテン方程式が基質による阻害を含むように拡張されました (式 S3)。

プレプロ DlPPO1 とプロ DlPPO1 は、III 型銅酵素の特徴的なオキシ状態の形成を誘導する H2O2 を使用して分光測光的に調査されました 102。 プレプロ-DlPPO1 またはプロ-DlPPO1 に H2O2 を添加すると、約 345 nm 付近に新しい吸収バンドが形成されます。これは、ジ銅中心の過酸化物誘発オキシ状態に特徴的なものです 87。 これらの実験では、255 μg のプロ-DlPPO1 (ε280 = 74,300 M-1 cm-1) または 300 μg のプレプロ-DlPPO1 (ε280 = 74,425 M-1 cm-1) を 200 μL の保存緩衝液 (100 mM) に混合しました。 MES および 200 mM NaCl、pH 6.5)。 〜345 nmの特徴的なピークが飽和に達するまで、数当量のH2O2を溶液に加えました。 調べた酵素に別の当量の H2O2 を添加するたびに、345 nm の特徴的な波長での吸収が安定するまで十分な時間 (ただし少なくとも 5 分間) を置き、それから次の当量の H2O2 を添加しました。 H2O2 を追加しても特徴的なピーク (約 345 nm) がそれ以上増加しなくなった時点で測定は終了しました。

pro-DlPPO1 のアミノ酸配列 (Ala1-Asp503) は SWISS-MODEL103,104 サーバーに送信されました。 最初に、パイプラインは、BLAST105 および HHblits106 に基づいて、調査された配列 (OU702517) の適切なテンプレートを検索しました。 検索の結果、最高のカバレージ値 (0.86、69.80% の配列同一性) を示すヒットとして、MdPPO166、Malusdomestica TYR 1 (PDB: 6ELS)35,36 が得られました。 次に、6ELS 構造をテンプレートとして使用して、プロ DlPPO1 の最終相同性モデルを作成し、PyMol 分子グラフィック システム (Schrödinger, LLC) を使用して視覚化を行いました 107。

分子ドッキングは、AutoDock Vina ソフトウェア 94 を使用して行われました。 ドッキング研究は、調査対象の天然基質である (-)-エピカテキン、4-メチルカテコール、カフェ酸、ピロガロールと、双銅中の標準基質であるドーパミン、l-DOPA、チラミン、l-チロシン、d-チロシンの結合状態を特定するために使用されました。 pro-DlPPO1 の活性中心。 プロＤＩＰＰＯ１の分子モデルは、ＭｄＰＰＯ１６６について前述したように、分子ドッキングのために調製した。 具体的には、プロＤＩＰＰＯ１の推定構造からＣ末端ドメイン（Ｐｒｏ３３６－Ａｓｐ５０３）を除去し、活性ドメイン（Ａｌａ１－Ｖａｌ３３５）のみをドッキング研究に使用した。 さらに、ゲートキーパー残基 (Phe260) は、植物 PPO でその柔軟性が検証されているため、柔軟な残基として定義されました 17。 すべての基質の構造は PubChem サーバーからダウンロードされ 108、次に AutoDockTools (ADT、v. 1.5.6) を使用して 3D pdb フォーマットに変換され、pdbqt ファイルに変換されました 109。 すべての基板について、アクティブなねじれの可能な限り最大数が選択されました。 極性水素は ADT によって構造に割り当てられ、基板の pdbqt ファイルにも保存されました。 すべての実験において、検索グリッドは 2 つの活性サイト銅イオンの中央に集中し、立方体 (12 × 12 × 12 Å3、格子点間隔: 1 Å) 上に広がり、エッジが 3 つの座標軸に平行になりました。ターゲット DlPPO1 モデル。 次に、AutoDock/Vina を使用して、調査した酵素と阻害剤を構成ファイル内のグリッド ボックスのプロパティとともに提供することでドッキングしました。 すべての測定において、エネルギー範囲は 5 に設定され、網羅性は 50 に設定されました。ドッキングの際、BmTYR 結晶構造 (PDB: 4P6R) からの共結晶化基質 l-チロシンを重ね合わせることで結合姿勢を評価しました。 BmTYR 構造における l-チロシンの結合姿勢から大きく逸脱したポーズ (つまり、フェノール環が二銅中心と相互作用していない基質ポーズ) は、「不合理な」ポーズとして特徴付けられました。 合理的なドッキング構成 (BmTYR (PDB: 4P6R)1 に類似した銅イオンに結合したフェノール環) は、視覚化ソフトウェア PyMol Molecular グラフィック システム (Schrödinger, LLC) を使用して 3D 画像としてプロットされました 107。

ドッキング研究後、目的の合理的な結合ポーズが pdb ファイルとして保存され、LigPlot + ソフトウェア 110,111 を使用してさらに視覚化され、リガンド (-)-エピカテキンと活性中心周囲の相互作用するアミノ酸残基間の相互作用が評価されました。 実行時パラメータは、ソフトウェアの提案に従って定義されました。 具体的には、水素結合は、水素と水素アクセプタとの間の最大範囲2.70Åまで、また、水素ドナーと水素アクセプタとの間の最大範囲3.35Åまで許容された。 非結合接触パラメーターは、リガンドとタンパク質の疎水性炭素間の最大距離 2.90 Å、およびリガンドとタンパク質の硫黄原子間の最大距離 3.90 Å として定義されました。

この研究で説明したすべての植物実験は、関連する制度的、国内的、国際的なガイドラインおよび法律に準拠していました。

提示された研究中に生成および分析された配列は、欧州ヌクレオチド アーカイブ (ENA) リポジトリからアクセッション OU702517 (部分プロ DlPPO1 遺伝子) および OU702518 (プレプ​​ロ DlPPO1 遺伝子) として入手できます。

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リファレンスをダウンロードする

この研究はオーストリア科学基金 (FWF): P32326 (AR) から資金提供を受けました。 LRは、エルンスト・マッハ助成金（MPC-2020-00926）およびASEA-UNINET（ICM-2019-15123）奨学金、およびモンクット王からのスキル開発助成金に対して、Österreichische Austauschdienst-Gesellschaft mit beschränkter Haftung（OeAD-GmbH）に深く感謝します。トンブリー工科大学 (KMUTT) からの資金援助。 LR、MP、IK、AR は Mag を認識します。 ESI-QTOF-MS 実験で多大なサポートをしていただいた Anna Fabisikova。 https://www.bpc.univie.ac.at/。

ウィーン大学化学学部生物物理化学研究所、Josef-Holaubek-Platz 2、1090、ウィーン、オーストリア

リーラ・ラックソン、マティアス・プレッツラー、ヨアニス・カンパチカス、アネット・ロンペル

キングモンクット工科大学トンブリ校（KMUTT）理学部化学科、トゥンクル、バンコク、10140、タイ

リーラ・ラックトーン

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アネット・ロンペルへの手紙。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

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公開日: 2022 年 11 月 25 日

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